Otto Frank studerade medicin i Munich och Kiel mellan 1884 och 1889 (licensierad i Munich 1889). Under 1889 till 1891 genomförde han utbildning i matematik, kemi, fysik, anatomi och zoologi i Heidelberg, Glasgow, Munich och Strasbourg. Han arbetade sedan fram till 1894 som assistent till Carl Friedrich Wilhelm Ludwig vid Physiologisches Institut i Leipzig. Där 1892 avslutade han sina doktorandstudier (doktorsexamen).

Därefter arbetade Frank från 1894 som assistent i Carl von Voits fysiologiska Institut I m Ubignchen där han studerade hjärtfunktion med hjälp av metoder härledda från tidigare termodynamiska analyser av skelettmuskelkontraktion. Hans arbete med hjärtmuskelns beteende var ämnet för hans postdoktorala arbete. År 1902 blev han en extraordinär Professor och från 1905 till 1908 genomförde han ytterligare arbete med detta ämne innan han blev full professor (Ordinariat). Sedan återvände han till m Ubignchen för att fortsätta detta arbete. Carl J. Wiggers besökte Franks laboratorium 1912 och fann Frank en ” lysande analytiker, en skicklig systematiker, en begåvad matematiker och en kreativ tänkare…”, men hemlighetsfull och svår att arbeta med. Wiggers återvände till USA hösten 1912 efter att ha smugglat ut kopior av några av Franks utrustning med honom, trots att Wiggers och Frank verkar ha upprätthållit hjärtliga relationer därefter. Frank verkar ha varit en krävande lärare och Richard Bing, redaktör för Journal of Molecular and Cellular Cardiology, som studerade med Frank, påminde honom som ’…en helig terror, hata medelmåttighet, och många en elev bet dammet i undersökningen i fysiologi’. Frank fortsatte att arbeta i m Ubignchen fram till sin påtvingade pension 1934 på grund av hans motstånd mot nazistregimen.