Tabulka 1. Zkratka, zdroj a ředění imunohistochemických markerů.

ENF hustota byla hodnocena ve 2-mm kůže punch biopsie vzorků použitím Neurolucida software (MicroBrightField Bioscience, USA) – čtyři 20× z-series konfokální obrazy (2 µm × 16 krocích), získané ze čtyř náhodně vybraných úseků pro každý vzorek. Dermální myelinizovaných nervových vláken byly kvantifikovány pomocí anti-myelin basic protein, protilátky na celý kožní povrch včetně 1 mm v hloubce od bazální membrány ve tři náhodné úseky pro každý vzorek, následující dříve publikovaný postup (Nolano et al., 2013). Kalibrované mřížky (2 × 1 mm) s série sedmi ekvidistantních rovnoběžek byl aplikován na digitální non-konfokální 5× zvětšení původní obraz myelin basic protein-barevné úseky. Byly spočítány všechny průniky mezi myelinizovanými vlákny a mřížkovými čarami. Hustota dermálních myelinizovaných nervových vláken byla vypočtena jako počet vláken zachycujících mřížku na dermální oblast(zachytí na mm2). Jeden operátor slepě kvantifikoval kožní nervové vlákno v každém vzorku. VIP-ir sudomotor nervu délka hustota (nm/mm3) byla vypočtena pomocí nervových obrysu modul Autoneuron, část Neurolucida softwaru , jak bylo popsáno dříve (Provitera et al., 2014). K posouzení peptidergic vlákna (SubP, CGRP a VIP-ir) v subepidermální nervové pleteně, do 100 µm od bazální membrány, semikvantitativní scoring byl aplikován (0 = absence vláken, 1 = vzácné vlákniny segmenty, kratší než 10 µm, 2 = několik vláken, vyplnění do značné míry denervated dermis, 3 = normální, několik vláken pokrývající většinu subepidermální neurální plexus).

Kožní biopsie nálezy u 10 pacientů bylo ve srovnání s odpovídající vzorek z 10 zdravých jedinců (epidermálních nervových vláken hustota: 18.9 ± 3.7/mm, dermální myelinizovaných vláken hustota: 6.7 ± 1.4/mm; Nolano et al., 2013).

Statistická analýza

všechna data jsou vyjádřena jako průměr ± SD. Normální distribuce epidermální a dermální myelinizované hustoty vláken byla hodnocena pomocí testu normality D ‚ Agostino a Pearson omnibus. Je například wilcoxon matched-pair test byl použit pro srovnání neurofyziologické a kožní biopsie proměnných mezi nedotčena a postižené strany. Mann Whitneyův test byl použit pro porovnání proměnných biopsie kůže mezi pacienty s PHN a normálními kontrolami. Korelace mezi hustotou ENF a dobou trvání PHN byly vypočteny pomocí Pearsonova korelačního koeficientu r. Hodnoty P menší nebo rovny 0,05 byly považovány za indikující statistickou významnost.

Výsledky

Na klinické vyšetření všech deset pacientů si stěžoval, smyslové deficity zapojeny všechny smyslové modality a hlášeny probíhající spontánní bolesti (NRS: 4.3 ± 1.4); pět pacientů také stěžovali, mechanické dynamické alodynií (NRS: 3.5 ± 0.7).

neurofyziologické testy prokázaly závažné abnormality zahrnující všechny testované proměnné. U všech pacientů Aß-fiber-zprostředkované blikání reflex, stimuluje postiženou stranu, vyvolalo abnormální (opožděné nebo chybějící) odpovědi. Laserové vnímavý prahové hodnoty byly vyšší a Aδ – a C-laserem evokovaných potenciál nižší amplitudy po stimulaci postižené straně, než po stimulaci nepostižené straně (p < 0.05, Wilcoxonův test). U 2 z 10 pacientů chyběly potenciály vyvolané laserem související se stimulací C-vláken také na neovlivněné straně (Tabulka 2).

Tabulka 2. Zkratka, zdroj a ředění imunohistochemických markerů.

Konfokální imunofluorescenční analýzy ukázaly, že kožní inervace v supraorbitální punč kožní biopsie od pacientů s PHN nápadně liší mezi nedotčena (Obrázky 2A,C,E) a postižené strany (Obr. 2B,D,F). Vzhledem k tomu, že kožní biopsie vzorky z nepostižené straně zobrazí poměrně hustou a pravidelnou inervace, pokožky v postižené straně se objevil špatně a nerovnoměrně inervovaných s klastry a dlouhé plochy bez nervových vláken (Obr. 2A–D). Semikvantitativní analýza ukázala, že subepidermální plexus objevil chudé a nepříčetný a oproti nepostižené straně, obsahovala méně (p < 0.001) CGRP (1.4 ± 0.8 vs. 2.5 ± 0.5), SubP (1.1 ± 0.6 vs. 2.3 ± 0.7) a VIP (1.0 ± 0.7 vs. 2.2 ± 0.8) imunoreaktivních (IR) nervových vláken. Vlasové folikuly vypadaly špatně inervované s několika nemyelinizovanými a myelinizovanými vlákny (obrázky 2F, E). Ztráta epidermální a dermální myelinizované vlákniny se pohybovala od středně těžké až těžké a 3 z 10 pacientů měli úplnou denervaci kůže. Několik přeživších epidermálních axonů bylo seskupeno mezi oblasti denervované epidermis. Myelinizovaná vlákna vykazovala několik morfologických abnormalit,jako je fragmentace, častý výskyt delší uzlové délky než obvykle (7 µm nebo delší; Nolano et al., 2003) a nepravidelnosti ráže se zvětšením a smrštěním (změna průměru nad 100%) ve stejné internodě. Tyto vlastnosti byly zřídka pozorovány na neovlivněné straně. V kontrastu s smyslové inervace, oba komponenty, adrenergní a cholinergní, autonomní inervace na kožní příloh se objevil relativně zachována (Obrázek 3). Nepostižené a postižené strany, zobrazí četné cholinergní (VIP-ir) sudomotor (Obr. 3C,D) a adrenergní (DbH-ir) pilomotor (Obr. 3E,F) vlákna. Hustota cholinergních sudomotorických nervových vláken se mezi postiženými nelišila (1,9 ± 0.7 nm / mm3) a neovlivněná strana (2,0 ± 0,5 nm / mm3).

Obrázek 2. Inervace kůže. Konfokální snímky ukazující inervaci kůže na neovlivněné (A,C,E) a postižené straně (B,D,F) U reprezentativního pacienta s PHN. Těžká epidermální a dermální ztráta nervových vláken je viditelná ve vzorcích biopsie kůže z postižené strany (B vs. A). Epidermis na postižené straně zobrazuje dlouhý trakt bez nervových vláken a klastrů nervových vláken (D vs. C). Stávkující nemyelinizovaná a myelinizovaná ztráta nervových vláken kolem vlasových folikulů (F vs. E). Tyče: 100 µm v (A,B,E,F); 25 µm v (C, D).

Obrázek 3. Autonomní inervace kůže. Konfokální obrazy ukazující autonomní inervaci k dermálním přílohám v postižené (A,C,E) a neovlivněné straně (B, D, F). Horní dermis kolem vlasových folikulů v postižené straně obsahuje méně vazoaktivní střevní peptid-imunoreaktivních (VIP-IR) vlákna než ve stejném dermální oblasti v nedotčeny strana (A vs. B) vzhledem k tomu, VIP-ir sudomotor a DbH-ir pilomotor inervace je dobře vybaven (D a F vs. C a E). Mříž: 100 µm v (A, B); 50 µm v (C,D), 25 µm v (E,F).

Kvantitativní analýzu (na základě analýzy PGP9.5 a myelinový bazický protein (MBP) imunoreaktivitu) z kožní biopsie vzorky vykazovaly výrazně nižší epidermální a dermální myelinových hustota vláken v postižené straně, než na nepostižené straně (3.1 ± 3.3 a 2.1 ± 2.8 vs. 17.2 ± 8.9 a 6,6 ± 5.0/mm2; p < 0.01, Tabulka 2). Poměr mezi epidermální a dermální myelinizovaná nervová vlákna byla výrazně nižší vliv než v nepostižené straně (1.1 ± 1.0 vs. 4.3 ± 5.3; p < 0.01).

ačkoli se hustota ENF zvyšovala s dobou trvání PHN, tato korelace nedosáhla statistické významnosti (r: 0,5574, p = 0,09; obrázek 4).

obrázek 4. Korelace mezi hustotou epidermálních nervových vláken (ENF) a dobou trvání PHN. I když ENF hustota se zvyšuje s PHN trvání, tato korelace minul statistické významnosti (epidermálních nervových vláken: r: 0.5574, p = 0.09).

průměrné hodnoty pro nemyelinizovaná a myelinizovaná nervová vlákna hustoty v nepostižené straně se nelišila od kontrol (epidermálních nervových vláken hustota: 17.2 ± 8.9/mm vs. 18.9 ± 3.7/mm; dermální myelinizovaných vláken hustota: 6.6 ± 5.0/mm vs. 6.7 ± 1.4/mm; p > 0.3, podle Mann-Whitney test). Nicméně, v dvou pacientů s abnormální C-vlákna-zprostředkované laserem evokované potenciály, kožní biopsie ukázala, epidermální a dermální myelinizovaných nervových vláken ztráty také v nepostižené straně (o 0,8 a 3,6/mm v nedotčeny a 0.0 0.3 / mm na postižené straně).

Diskuse

Naše klinické a morfometrické studie, posouzení kožní inervace v supraorbitální punč kožní biopsie s nepřímé imunofluorescence a konfokální mikroskopie, poskytuje nové informace, upřesňuje, že i když oční PHN ovlivňuje epidermální nemyelinizovaná a dermální myelinizovaných nervových vláken, převážně škody nemyelinizovaná nervová vlákna a náhradní díly autonomní inervace kůže.

klinické vyšetření ukázalo, že všichni pacienti měli hmatovou, špendlíkovou a teplou hypestezii. V souladu s tím byly všechny tři neurofyziologické proměnné, které jsme zaznamenali (blikající reflex zprostředkovaný vlákny Aß, potenciály evokované laserem Aδ A C) abnormální. Vzhledem k tomu, že klinické hodnocení a neurofyziologická testování ukázalo, že se oba myelinizovaná i nemyelinizovaná vlákna poškození, kožní biopsie posouzení uvedeno, že PHN-související poškození kůže inervace lišily v myelinizovaná a nemyelinizovaná vlákna. Přesněji řečeno, nižší nemyelinizovaná/myelinových poměr v postižené straně, než v nezasažených zrcadla straně naznačuje převládající epidermální nemyelinizovaná nervová vlákna ztrátu. Toto nové morfometrické zjištění souhlasí s předchozí studií, která se zabývala kožní inervace sám a ukázal, variabilní nemyelinizovaná vlákna ztráta (Oaklander, 2001; Petersen et al., 2010; Reda a kol., 2013). Převládající nemyelinizovaná nervová vlákna zapojení jsme popsali u pacientů s PHN zapadá do jejich typicky probíhající bolesti. Tento typ bolesti pravděpodobně odráží sekundární neuroplastický změny a spontánní hyperaktivita v anatomicky denervated druhého řádu nociceptivních neuronů (Truini et al., 2013). Vzhledem k malému studijnímu vzorku jsme nemohli spolehlivě prozkoumat možné korelace mezi bolestí a klinickými, neurofyziologické a morfologické abnormality. Tato otázka si zaslouží vyšetřování v další studii, která zahrnuje více pacientů.

V tomto kožní biopsie studie, pomocí nepřímé imunofluorescence a konfokální mikroskopie, poskytujeme dříve nehlášené podrobné informace o kůži autonomní inervace u pacientů s oční PHN. Zatímco autonomní inervace potních žláz a svalů erector pilorum byla ušetřena, Pozorovali jsme špatné zastoupení VIP-IR vláken v horní dermis, kolem cév a vlasových folikulů, kde bylo také špatné zastoupení CGRP a SubP. Některá z těchto vláken modulují funkci vlasových folikulů a vazomotorickou kontrolu obličeje a mohou pocházet ze senzorického trigeminálního nervu (Izumi, 1995, 1999). Tento původ může vysvětlit jejich zapojení do PHN, zatímco nezúčastněná sudomotorická a pilomotorická VIP-IR nervová vlákna pravděpodobně pocházejí z nadřazených cervikálních sympatických ganglií az kraniálních parasympatických nervů, které PHN ponechává neporušené. Vzhledem k tomu, že mnoho studií naznačuje, že autonomní nervový systém se může podílet na vývoji bolesti (Fields et al ., 1998), autonomní nervová vlákna šetřící zde popisujeme, může podporu navrhované nepřímé spojení mezi intaktní sympatických postgangliových a poškozené primární aferentní nemyelinizovaná neuronů (Drummond et al., 2014).

V našich pacientů s oční PHN kožní biopsie výsledky ukázaly, že několik přeživší axony v postižené straně shlukli mezi oblastmi denervated epidermis a ENF, že hustota tendenci se zvyšovat s dobou trvání onemocnění. Toto pozorování nás vede k domněnce, že kůže by mohla v průběhu času podstoupit nějakou remodelaci nervů. K těmto změnám by mohlo dojít, když přežívající axony vyklíčí kolaterály ve snaze obsadit denervované území. Tato anatomická remodelace může také přinést určité funkční zlepšení. Je pravda, že naše hypotéza naznačuje částečné reinnervation v průběhu času u pacientů s oční PHN argumentuje proti pivotní studie týkající se přírodní historie hrudní PHN (Petersen et al., 2010; Reda a kol., 2013). Těchto studií pomocí funkční opatření a kožní biopsie konstatovat, že i na 7.7 roky, tam je jen mírné oživení smyslových funkcí a žádné anatomické oživení navzdory bolesti rozlišení u většiny pacientů. Zejména, studie Reda a kolegové ukázali, že i když bolest a většina opatření smyslové funkce, senzorické příznaky, a kapsaicin reakci na pokračující trend směrem ke zlepšení během dlouhodobého sledování-up, mnoho jedinců stále zkušený smyslové abnormality. I když nelze vyloučit, že spolehlivost našich zjištění může být ovlivněno malým vzorkem pacientů, zda trojklanného systému, zvláštní území, je více náchylný k kožní reinnervation než jiné oblasti těla, zůstává zajímavou otázkou pro budoucí výzkum.

průměrná hustota epidermální a dermální myelinizované vlákniny a jejich poměr na neovlivněné zrcadlové straně se nelišily od kontrol. Nicméně ve dvou z deseti pacientů jsme studovali, C-vláken souvisejících s laserem evokované potenciály chyběly po stimulaci nepostižené straně a oba pacienti měli mírné epidermální ztráta vlákno, i když méně závažné ve nedotčena, než v postižené straně. Toto zjištění je v souladu s předchozími klinických, neurofyziologických a kožní biopsie studie, které ukazují, bilaterální poškození nervových vláken a podporuje hypotézu, že PHN mohou občas způsobit mírné, subklinické senzorické aferentní dráha účast na nepostižené straně (Haanpää et al., 1997; Oaklander et al., 1998; Truini a kol., 2008).

Naše kožní biopsie studie ukazují, že oční PHN rozdílně ovlivňuje epidermální a dermální myelinizovaných vláken a náhradní díly autonomní inervace kůže poskytuje nové informace pro pochopení mechanismů, na nichž tento zakázání stavu.

Autor Příspěvky

Střet Zájmů Prohlášení

autoři prohlašují, že výzkum byl prováděn v nepřítomnosti jakékoli obchodní nebo finanční vztahy, které by mohlo být chápáno jako potenciální konflikt zájmů.

Poznámky pod čarou

1. ^ http://www.ihs-classification.org/_downloads/mixed/International-Headache-Classification-III-ICHD-III-2013-Beta.pdf