Die PID ist eine Form der genetischen Diagnose, die vor der Implantation durchgeführt wird. Dies bedeutet, dass die Eizellen des Patienten in vitro befruchtet und die Embryonen in Kultur gehalten werden sollten, bis die Diagnose gestellt ist. Es ist auch notwendig, eine Biopsie an diesen Embryonen durchzuführen, um Material für die Diagnose zu erhalten. Die Diagnose selbst kann mit verschiedenen Techniken durchgeführt werden, abhängig von der Art des untersuchten Zustands. Im Allgemeinen werden PCR-basierte Methoden für monogene Störungen und FISH für Chromosomenanomalien und für die Geschlechtsbestimmung derjenigen Fälle verwendet, in denen kein PCR-Protokoll für eine X-chromosomale Erkrankung verfügbar ist. Diese Techniken müssen angepasst werden, um an Blastomeren durchgeführt zu werden, und müssen vor der klinischen Anwendung gründlich an Einzelzellmodellen getestet werden. Schließlich können nach dem Embryoersatz überschüssige, nicht betroffene Embryonen guter Qualität kryokonserviert, aufgetaut und in einem nächsten Zyklus zurücktransferiert werden.

Gewinnung von Embryonenbearbeiten

Derzeit werden alle PID-Embryonen durch assistierte Reproduktionstechnologie gewonnen, obwohl in der Vergangenheit versucht wurde, natürliche Zyklen und In-vivo-Befruchtung mit anschließender Gebärmutterspülung zu verwenden, und nun weitgehend aufgegeben wird. Um eine große Gruppe von Eizellen zu erhalten, werden die Patienten einer kontrollierten Ovarialstimulation (COH) unterzogen. COH wird entweder in einem Agonistenprotokoll unter Verwendung von Gonadotropin-Releasing-Hormon (GnRH) -Analoga zur Hypophysendesensibilisierung in Kombination mit humanen menopausalen Gonadotropinen (hMG) oder rekombinantem follikelstimulierendem Hormon (FSH) oder einem Antagonistenprotokoll unter Verwendung von rekombinantem FSH in Kombination mit einem GnRH-Antagonisten gemäß klinischer Beurteilung des Patientenprofils (Alter, Body-Mass-Index (BMI), endokrine Parameter). hCG wird verabreicht, wenn beim transvaginalen Ultraschall mindestens drei Follikel mit einem mittleren Durchmesser von mehr als 17 mm beobachtet werden. Die transvaginale ultraschallgeführte Entnahme von Eizellen ist 36 Stunden nach der hCG-Verabreichung geplant. Die Lutealphasen-Supplementierung besteht aus der täglichen intravaginalen Verabreichung von 600 µg natürlichem mikronisiertem Progesteron.

Oozyten werden sorgfältig von den Cumuluszellen denudiert, da diese Zellen bei der PID eine Kontaminationsquelle darstellen können, wenn PCR-basierte Technologie verwendet wird. In der Mehrzahl der gemeldeten Zyklen wird die intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) anstelle von IVF verwendet. Die Hauptgründe sind, eine Kontamination mit an der Zona pellucida haftenden Spermienresten zu verhindern und ein unerwartetes Versagen der Befruchtung zu vermeiden. Das ICSI-Verfahren wird an reifen Metaphase-II-Oozyten durchgeführt und die Befruchtung wird 16-18 Stunden danach beurteilt. Die Embryonalentwicklung wird jeden Tag vor der Biopsie und bis zum Transfer in die Gebärmutter der Frau weiter untersucht. Während der Spaltphase wird täglich eine Embryobewertung auf der Grundlage der Anzahl, Größe, Zellform und Fragmentierungsrate der Blastomere durchgeführt. Am Tag 4 wurden die Embryonen in Abhängigkeit von ihrem Verdichtungsgrad bewertet und die Blastozysten nach der Qualität des Throphectoderms und der inneren Zellmasse sowie nach ihrem Expansionsgrad bewertet.

Biopsieverfahrenbearbeiten

Da die PID an Zellen aus verschiedenen Entwicklungsstadien durchgeführt werden kann, variieren die Biopsieverfahren entsprechend. Theoretisch kann die Biopsie in allen Präimplantationsstadien durchgeführt werden, es wurden jedoch nur drei vorgeschlagen: an unbefruchteten und befruchteten Eizellen (für Polkörper, PBs), an Embryonen im Spaltstadium am dritten Tag (für Blastomere) und an Blastozysten (für Trophektodermzellen).

Das Biopsieverfahren umfasst immer zwei Schritte: die Öffnung der Zona pellucida und die Entfernung der Zelle(n). Es gibt verschiedene Ansätze für beide Schritte, einschließlich mechanischer, chemischer und physikalischer (Tyrodes saure Lösung) und Lasertechnologie zum Durchbrechen der Zona pellucida, Extrusion oder Aspiration zur Entfernung von PBs und Blastomeren und Herniation der Trophektodermzellen.

Polkörperbiopsiebearbeiten

Eine Polkörperbiopsie ist die Entnahme eines Polkörpers, einer kleinen haploiden Zelle, die während der Oogenese gleichzeitig als Eizelle gebildet wird, aber im Allgemeinen nicht befruchtet werden kann. Im Vergleich zu einer Blastozystenbiopsie kann eine Polkörperbiopsie möglicherweise kostengünstiger, weniger schädlich sein Nebenwirkungen und empfindlicher bei der Erkennung von Anomalien. Der Hauptvorteil der Verwendung von Polarkörpern in der PID besteht darin, dass sie für eine erfolgreiche Befruchtung oder eine normale Embryonalentwicklung nicht erforderlich sind und somit keine schädlichen Auswirkungen auf den Embryo haben. Einer der Nachteile der PB-Biopsie besteht darin, dass sie nur Informationen über den mütterlichen Beitrag zum Embryo liefert, weshalb Fälle von maternal vererbten autosomal-dominanten und X-chromosomalen Störungen, die ausschließlich maternal übertragen werden, diagnostiziert werden können und autosomal-rezessive Störungen nur teilweise diagnostiziert werden können. Ein weiterer Nachteil ist das erhöhte Risiko von diagnostischen Fehlern, beispielsweise durch den Abbau des genetischen Materials oder Rekombinationsereignisse, die zu heterozygoten ersten Polkörpern führen.

Biopsie im Spaltstadium (Blastomerbiopsie)Bearbeiten

Die Biopsie im Spaltstadium wird im Allgemeinen am Morgen des dritten Tages nach der Befruchtung durchgeführt, wenn sich normal entwickelnde Embryonen das Acht-Zellen-Stadium erreichen. Die Biopsie wird normalerweise an Embryonen mit weniger als 50% anukleären Fragmenten und in einem 8-zelligen oder späteren Entwicklungsstadium durchgeführt. Ein Loch wird in der Zona pellucida gemacht und ein oder zwei Blastomere, die einen Kern enthalten, werden sanft abgesaugt oder durch die Öffnung extrudiert.Der Hauptvorteil der Biopsie im Spaltstadium gegenüber der PB-Analyse besteht darin, dass der genetische Input beider Elternteile untersucht werden kann. Andererseits weisen Embryonen im Spaltstadium eine hohe chromosomale Mosaikrate auf, was in Frage stellt, ob die an einem oder zwei Blastomeren erzielten Ergebnisse für den Rest des Embryos repräsentativ sind. Aus diesem Grund verwenden einige Programme eine Kombination aus PB-Biopsie und Blastomerbiopsie. Darüber hinaus liefert die Biopsie im Spaltstadium, wie im Fall der PB-Biopsie, eine sehr begrenzte Menge an Gewebe für die Diagnose, was die Entwicklung von Einzelzell-PCR- und FISH-Techniken erfordert.Obwohl theoretisch PB-Biopsie und Blastozystenbiopsie weniger schädlich sind als die Biopsie im Spaltstadium, ist dies immer noch die vorherrschende Methode. Es wird in ungefähr 94% der dem ESHRE-PID-Konsortium gemeldeten PID-Zyklen verwendet. Die Hauptgründe sind, dass es eine sicherere und vollständigere Diagnose als die PB-Biopsie ermöglicht und im Gegensatz zur Blastozystenbiopsie immer noch genügend Zeit bleibt, um die Diagnose zu beenden, bevor die Embryonen in der Gebärmutter des Patienten ersetzt werden müssen.Von allen Spaltstadien ist allgemein anerkannt, dass der optimale Zeitpunkt für die Biopsie im Acht-Zellen-Stadium liegt. Es ist diagnostisch sicherer als die PB-Biopsie und ermöglicht im Gegensatz zur Blastozystenbiopsie die Diagnose der Embryonen vor dem 5. Tag. In diesem Stadium sind die Zellen noch totipotent und die Embryonen verdichten sich noch nicht. Obwohl gezeigt wurde, dass bis zu einem Viertel eines menschlichen Embryos entfernt werden kann, ohne seine Entwicklung zu stören, muss noch untersucht werden, ob die Biopsie einer oder zweier Zellen mit der Fähigkeit des Embryos korreliert, sich weiterzuentwickeln, zu implantieren und zu wachsen eine Vollzeitschwangerschaft.

Nicht alle Methoden zum Öffnen der Zona pellucida haben die gleiche Erfolgsrate, da das Wohlbefinden des Embryos und / oder des Blastomers durch das für die Biopsie verwendete Verfahren beeinträchtigt werden kann. Das Zona-Bohren mit saurer Tyrode-Lösung (ZD) wurde im Vergleich zur partiellen Zona-Dissektion (PZD) untersucht, um festzustellen, welche Technik zu erfolgreicheren Schwangerschaften führen und weniger Auswirkungen auf den Embryo und / oder das Blastomer haben würde. ZD verwendet ein Verdauungsenzym wie Pronase, das es zu einer chemischen Bohrmethode macht. Die in ZD verwendeten Chemikalien können eine schädigende Wirkung auf den Embryo haben. PZD verwendet eine Glas-Mikronadel, um die Zona pellucida zu schneiden, was es zu einer mechanischen Dissektionsmethode macht, die typischerweise qualifizierte Hände benötigt, um das Verfahren durchzuführen. In einer Studie, die 71 Paare umfasste, wurde ZD in 26 Zyklen von 19 Paaren und PZD in 59 Zyklen von 52 Paaren durchgeführt. In der Einzelzellanalyse gab es eine Erfolgsquote von 87,5% in der PZD-Gruppe und 85,4% in der ZD-Gruppe. Das Alter der Mutter, die Anzahl der entnommenen Eizellen, die Befruchtungsrate und andere Variablen unterschieden sich nicht zwischen den ZD- und PZD-Gruppen. Es wurde festgestellt, dass PZD zu einer signifikant höheren Schwangerschaftsrate (40,7% gegenüber 15,4%), einer anhaltenden Schwangerschaft (35,6% gegenüber 11,5%) und einer Implantation (18,1% gegenüber 5,7%) führte als ZD. Dies deutet darauf hin, dass die Verwendung der mechanischen Methode der PZD in Blastomerbiopsien für die Präimplantationsdiagnostik möglicherweise kompetenter ist als die Verwendung der chemischen Methode der ZD. Der Erfolg von PZD gegenüber ZD könnte darauf zurückgeführt werden, dass der chemische Wirkstoff in ZD eine schädliche Wirkung auf den Embryo und / oder das Blastomer hat. Derzeit ist das Zonenbohren mit einem Laser die vorherrschende Methode zum Öffnen der Zona pellucida. Die Verwendung eines Lasers ist eine einfachere Technik als die Verwendung mechanischer oder chemischer Mittel. Das Laserbohren kann jedoch für den Embryo schädlich sein und ist für In-vitro-Fertilisationslabors sehr teuer, insbesondere wenn die PID in der heutigen Zeit kein weit verbreiteter Prozess ist. PZD könnte eine praktikable Alternative zu diesen Problemen sein.

Blastozystenbiopsiebearbeiten

In einem Versuch, die Schwierigkeiten im Zusammenhang mit Einzelzelltechniken zu überwinden, wurde vorgeschlagen, Embryonen im Blastozystenstadium zu biopsieren, um eine größere Menge an Ausgangsmaterial für die Diagnose bereitzustellen. Es hat sich gezeigt, dass, wenn mehr als zwei Zellen in demselben Probenröhrchen vorhanden sind, die wichtigsten technischen Probleme der Einzelzell-PCR oder FISH praktisch verschwinden würden. Andererseits können, wie bei der Biopsie im Spaltstadium, die chromosomalen Unterschiede zwischen der inneren Zellmasse und dem Trophektoderm (TE) die Genauigkeit der Diagnose verringern, obwohl berichtet wurde, dass dieser Mosaizismus niedriger ist als bei Embryonen im Spaltstadium.

Die TE-Biopsie hat sich in Tiermodellen wie Kaninchen, Mäusen und Primaten als erfolgreich erwiesen. Diese Studien zeigen, dass die Entfernung einiger TE-Zellen der weiteren In-vivo-Entwicklung des Embryos nicht abträglich ist.

Die menschliche Blastozystenbiopsie für die PID wird durchgeführt, indem am dritten Tag der In-vitro-Kultur ein Loch in das ZP gebohrt wird. Dadurch kann der sich entwickelnde TE nach der Blastulation herausragen, was die Biopsie erleichtert. Am fünften Tag nach der Befruchtung werden etwa fünf Zellen mit einer Glasnadel oder Laserenergie aus dem Embryo herausgeschnitten, so dass der Embryo weitgehend intakt und ohne Verlust der inneren Zellmasse bleibt. Nach der Diagnose können die Embryonen während desselben Zyklus ersetzt oder kryokonserviert und in einem nachfolgenden Zyklus übertragen werden.

Dieser Ansatz hat aufgrund des Stadiums, in dem er durchgeführt wird, zwei Nachteile. Zunächst erreicht nur etwa die Hälfte der Präimplantationsembryonen das Blastozystenstadium. Dies kann die Anzahl der für die Biopsie verfügbaren Blastozysten einschränken und in einigen Fällen den Erfolg der PID einschränken. Mc Arthur und Mitarbeiter berichten, dass 21% der begonnenen PID-Zyklen keinen Embryo hatten, der für eine TE-Biopsie geeignet war. Diese Zahl ist ungefähr viermal höher als der Durchschnitt der Daten des ESHRE-PID-Konsortiums, wo PB und Biopsie im Spaltstadium die vorherrschenden berichteten Methoden sind. Andererseits begrenzt die Verzögerung der Biopsie auf dieses späte Entwicklungsstadium die Zeit für die Durchführung der genetischen Diagnose, was es schwierig macht, eine zweite PCR-Runde durchzuführen oder FISH-Sonden zu rehybridisieren, bevor die Embryonen wieder an den Patienten übertragen werden sollten.

Cumuluszell-Probenahmeedit

Die Probenahme von Cumuluszellen kann zusätzlich zu einer Probenahme von Polkörpern oder Zellen aus dem Embryo durchgeführt werden. Aufgrund der molekularen Wechselwirkungen zwischen Cumuluszellen und der Eizelle kann ein Genexpressionsprofil von Cumuluszellen durchgeführt werden, um die Eizellqualität und die Effizienz eines ovariellen Überstimulationsprotokolls abzuschätzen, und kann indirekt vorhersagen Aneuploidie, Embryoentwicklung und Schwangerschaftsergebnisse.

Nicht-invasive genetische Präimplantations-Screening-Methoden (NIPGS)Bearbeiten

Die traditionelle Embryonenbiopsie kann invasiv und kostspielig sein. Daher haben die Forscher eine laufende Suche nach einer weniger invasiven Methoden für die Präimplantationsdiagnostik zu finden. Studien zu neuen nicht-invasiven präimplantationsgenetischen Screening-Methoden (NIPGS) wie Blastocoel-Flüssigkeit und verbrauchte Embryonenmedien wurden kürzlich als Alternative zu herkömmlichen Methoden veröffentlicht

Präimplantationsgenetische Screening-Tests mit Blastocoel-Flüssigkeit (BF)Während eines normalen IVF-Prozesses erhöht eine gute Praxis zur Vitrifizierung von Embryonen die Chance auf eine gesunde Schwangerschaft. Während des Verglasungsprozesses wird eine entwickelte Explosion dehydriert und sie und ihre Blastocoel-Kavität kollabieren für den Gefrierprozess. Es gibt viele Methoden, die verwendet wurden, um den Kollaps zu erleichtern, einschließlich Laserpuls, wiederholtes Mikropipettieren, Mikronadel-Punktion oder Mikroabsaugung Normalerweise würde diese Flüssigkeit dann verworfen werden, aber mit Präimplantations-Gentests von BL wird diese Flüssigkeit gespeichert und dann auf DNA getestet. Es wird angenommen, dass diese DNA aus Zellen stammt, die Apoptose im sich entwickelnden Embryo durchlaufen haben

Präimplantationsgenetische Tests mit Blastozystenkultur konditioniertem Medium (BCCM)Eine andere Methode für weniger invasive präimplantationsgenetische Tests besteht darin, die Kulturmedien zu testen, in denen sich der Embryo entwickelt hat. Es wurde festgestellt, dass der Embryo DNA-Fragmente aus den Zellen freisetzt, die innerhalb der Inkubationszeit gestorben sind. Mit diesem Wissen haben Wissenschaftler argumentiert, dass sie diese DNA isolieren und für Präimplantations-Gentests verwenden könnten

Die Vorteile und Folgen von weniger invasiven Präimplantations-Gentests Während es widersprüchliche Beweise dafür gibt, ob die traditionelleren Methoden der Präimplantations-Gentests für den Embryo schädlich sind oder nicht, gibt es neuere Methoden für weniger invasive und gleichermaßen wirksame Testmethoden. Zu diesem Zweck haben wir uns der Präimplantationsdiagnostik mit Blastocoel-Flüssigkeit und verbrauchten Embryonenmedien zugewandt. Ein Problem für diese Alternativen ist die minimale Menge an DNA, mit der gearbeitet werden kann. Eine weitere sehr wichtige Frage ist, ob diese Technologie genau ist oder nicht. Beide Bedenken wurden kürzlich von Kusnezow angesprochen. Kusnezow beschloss, beide Methoden zu verwenden, um die Menge an DNA zu kombinieren, die aus beiden Techniken gewonnen wurde. Sobald die DNA isoliert war, wurde sie für genetische Präimplantationstests verwendet. Die Ergebnisse zeigten, dass, wenn beide Methoden Blastozystenflüssigkeit und Embryo-verbrauchte Medien in Kombination verwendet wurden, sie eine Cordance-Rate für die gesamte Chromosomenkopie von 87 zeigten.5% im Vergleich zum Trophektoderm, 96,4% im Vergleich zur gesamten Blastozyste (Goldstandard). Zusätzlich konnten sie nach der Amplifikation mit dieser neuen Methode 25,0-54,0 ng / ul DNA pro Probe produzieren. Mit traditionellen Methoden wie Trophectoderm sammelten sie 10 bis 44 ng / ul

Genetische Analysetechnikenbearbeiten

Fluoreszierende in-situ-Hybridisierung (FISH) und Polymerasekettenreaktion (PCR) sind die beiden am häufigsten verwendeten Technologien der ersten Generation in der PID. PCR wird im Allgemeinen verwendet, um monogene Störungen zu diagnostizieren, und FISH wird zum Nachweis von Chromosomenanomalien verwendet (z. B. Aneuploidie-Screening oder chromosomale Translokationen). In den letzten Jahren haben verschiedene Fortschritte bei der PID-Untersuchung eine Verbesserung der Vollständigkeit und Genauigkeit der verfügbaren Ergebnisse in Abhängigkeit von der verwendeten Technologie ermöglicht. Kürzlich wurde eine Methode entwickelt, mit der Metaphasenplatten aus einzelnen Blastomeren fixiert werden können. Diese Technik in Verbindung mit FISH, m-FISH kann zuverlässigere Ergebnisse liefern, da die Analyse an ganzen Metaphasenplatten durchgeführt wird

Zusätzlich zu FISH und PCR wird die Einzelzellgenomsequenzierung als Methode der Präimplantationsdiagnostik getestet. Dies charakterisiert die vollständige DNA-Sequenz des Genoms des Embryos.

FISHEdit

FISH ist die am häufigsten angewandte Methode zur Bestimmung der chromosomalen Konstitution eines Embryos. Im Gegensatz zur Karyotypisierung kann es auf Interphasen-Chromosomen verwendet werden, so dass es auf PBs, Blastomeren und TE-Proben verwendet werden kann. Die Zellen werden auf Glas-Objektträgern fixiert und mit DNA-Sonden hybridisiert. Jede dieser Sonden ist spezifisch für einen Teil eines Chromosoms und mit einem Fluorochrom markiert.Dual FISH wurde als effiziente Technik zur Bestimmung des Geschlechts menschlicher Präimplantationsembryonen und der zusätzlichen Fähigkeit zum Nachweis abnormaler Chromosomenkopien angesehen, was über die Polymerasekettenreaktion (PCR) nicht möglich ist.Derzeit ist eine große Anzahl von Sonden für verschiedene Segmente aller Chromosomen verfügbar, aber die begrenzte Anzahl verschiedener Fluorochrome begrenzt die Anzahl der Signale, die gleichzeitig analysiert werden können.

Die Art und Anzahl der Sonden, die an einer Probe verwendet werden, hängt von der Indikation ab. Zur Geschlechtsbestimmung (z. B. wenn ein PCR-Protokoll für eine bestimmte X-chromosomale Störung nicht verfügbar ist) werden Sonden für die X- und Y-Chromosomen zusammen mit Sonden für eines oder mehrere der Autosomen als interne FISH-Kontrolle angewendet. Weitere Sonden können hinzugefügt werden, um nach Aneuploidien zu suchen, insbesondere nach solchen, die zu einer lebensfähigen Schwangerschaft führen könnten (z. B. einer Trisomie 21). Die Verwendung von Sonden für Chromosomen X, Y, 13, 14, 15, 16, 18, 21 und 22 hat das Potenzial, 70% der bei Spontanaborten gefundenen Aneuploidien nachzuweisen.

Um mehr Chromosomen an derselben Probe analysieren zu können, können bis zu drei aufeinanderfolgende FISH-Runden durchgeführt werden. Bei Chromosomenumlagerungen müssen spezifische Kombinationen von Sonden gewählt werden, die die interessierende Region flankieren. Die FISH-Technik hat eine Fehlerrate zwischen 5 und 10%.

Das Hauptproblem bei der Verwendung von FISCHEN zur Untersuchung der chromosomalen Konstitution von Embryonen ist die erhöhte Mosaikrate, die im menschlichen Präimplantationsstadium beobachtet wird. Eine Metaanalyse von mehr als 800 Embryonen ergab, dass etwa 75% der Präimplantationsembryonen mosaikartig sind, davon etwa 60% diploid–aneuploides Mosaik und etwa 15% aneuploides Mosaik. Li und Mitarbeiter fanden heraus, dass 40% der Embryonen, die am Tag 3 als aneuploid diagnostiziert wurden, am Tag 6 eine euploide innere Zellmasse aufwiesen. Staessen und Mitarbeiter fanden heraus, dass 17,5% der Embryonen, die während der PGS als abnormal diagnostiziert und einer Reanalyse nach der PID unterzogen wurden, auch normale Zellen enthielten, und 8,4% wurden als grob normal befunden. Infolgedessen wurde in Frage gestellt, ob die eine oder zwei Zellen, die von einem Embryo untersucht wurden, tatsächlich repräsentativ für den vollständigen Embryo sind und ob lebensfähige Embryonen aufgrund der Einschränkungen der Technik nicht verworfen werden.

PCREdit

Kary Mullis konzipierte die PCR 1985 als in vitro vereinfachte Reproduktion des In vivo-Prozesses der DNA-Replikation. Die PCR nutzt die chemischen Eigenschaften der DNA und die Verfügbarkeit thermostabiler DNA-Polymerasen und ermöglicht die Anreicherung einer DNA-Probe für eine bestimmte Sequenz. Die PCR bietet die Möglichkeit, eine große Menge von Kopien eines bestimmten Abschnitts des Genoms zu erhalten, was eine weitere Analyse ermöglicht. Es handelt sich um eine hochsensible und spezifische Technologie, die sich für alle Arten der genetischen Diagnostik, einschließlich der PID, eignet. Derzeit gibt es viele verschiedene Variationen der PCR selbst sowie der verschiedenen Methoden zur posterioren Analyse der PCR-Produkte.

Bei der Verwendung der PCR in der PID steht man vor einem Problem, das in der routinemäßigen genetischen Analyse nicht vorhanden ist: die winzigen Mengen an verfügbarer genomischer DNA. Da die PID an einzelnen Zellen durchgeführt wird, muss die PCR angepasst und an ihre physikalischen Grenzen gebracht werden und die minimal mögliche Menge an Template verwenden: ein Strang. Dies impliziert einen langen Prozess der Feinabstimmung der PCR-Bedingungen und eine Anfälligkeit für alle Probleme der konventionellen PCR, aber mehrere Grade intensiviert. Die hohe Anzahl der benötigten PCR-Zyklen und die begrenzte Menge an Template machen die Einzelzell-PCR sehr kontaminationsempfindlich. Ein weiteres spezifisches Problem der Einzelzell-PCR ist das Allel Drop out (ADO) Phänomen. Es besteht aus der zufälligen Nichtamplifikation eines der in einer heterozygoten Probe vorhandenen Allele. ADO beeinträchtigt die Zuverlässigkeit der PID ernsthaft, da ein heterozygoter Embryo als betroffen oder nicht betroffen diagnostiziert werden kann, je nachdem, welches Allel nicht amplifiziert werden kann. Dies gilt insbesondere für die PID bei autosomal dominanten Erkrankungen, bei denen die ADO des betroffenen Allels zum Transfer eines betroffenen Embryos führen kann.

Mehrere PCR-basierte Assays wurden für verschiedene Krankheiten entwickelt, wie die Triplett-Repeat-Gene, die mit myotoner Dystrophie und fragilem X in einzelnen menschlichen Körperzellen, Gameten und Embryonen assoziiert sind.

NGSEdit

Ab 2014 wird im PGT Next Generation Sequencing (NGS) durchgeführt. NGS, auch bekannt als Massive Parallel Sequencing, ist eine Gruppe von Techniken, die in der Lage sind, große Mengen an DNA zu angemessenen Kosten und Zeiten zu sequenzieren. Es kann uns eine allgemeine Perspektive des vollständigen Embryonengenoms geben, einschließlich des mitochondrialen. Diese Techniken basieren auf der Sequenzierung kurzer Lesevorgänge mit jeweils etwa 400 Basen und der Überlappung dieser Lesevorgänge mit einer leistungsstarken Ausrichtungssoftware.

Ebenso können wir mit NGS auch Aneuploidien in den 24 Chromosomen und Einzelgendefekte nachweisen, wenn ein Hinweis von den Trägereltern vorliegt. Der Hauptvorteil besteht darin, dass NGS den Nachweis von Aneuploidien und monogenen Erkrankungen mit einer einzigen Biopsie kombinieren und die erschwinglichen Kosten senken kann, wodurch sie zugänglicher wird.

Zwei Beispiele für NGS sind die Pyrosequenzierung und der reversible Farbstoffterminator.

Diagnosestellung

Die Diagnosestellung bei der PID ist nicht immer einfach. Die Kriterien für die Auswahl der Embryonen, die nach FISH- oder PCR-Ergebnissen ersetzt werden sollen, sind nicht in allen Zentren gleich.Bei FISCHEN werden in einigen Zentren nach der Analyse von einem oder zwei Blastomeren nur Embryonen ersetzt, die chromosomal normal sind (d. h. zwei Signale für die Gonosomen und die analysierten Autosomen aufweisen), und wenn zwei Blastomere analysiert werden, sollten die Ergebnisse übereinstimmen. Andere Zentren argumentieren, dass als monosom diagnostizierte Embryonen übertragen werden könnten, da die falsche Monosomie (d. H. Der Verlust eines FISH-Signals in einer normalen diploiden Zelle) die am häufigsten auftretende Fehldiagnose ist. In diesen Fällen besteht kein Risiko für eine aneuploide Schwangerschaft, und normale diploide Embryonen gehen aufgrund eines FISH-Fehlers nicht für den Transfer verloren. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Embryonen, die am Tag 3 als monosom diagnostiziert wurden (mit Ausnahme der Chromosomen X und 21), sich niemals zu Blastozysten entwickeln, was mit der Tatsache korreliert, dass diese Monosomien bei laufenden Schwangerschaften niemals beobachtet werden.

Diagnose und Fehldiagnose bei der PID mittels PCR wurden in der Arbeit von Navidi und Arnheim sowie von Lewis und Mitarbeitern mathematisch modelliert. Die wichtigste Schlussfolgerung dieser Veröffentlichungen ist, dass für die effiziente und genaue Diagnose eines Embryos zwei Genotypen erforderlich sind. Dies kann auf einem verknüpften Marker- und Krankheitsgenotyp einer einzelnen Zelle oder auf Marker- /Krankheitsgenotypen zweier Zellen beruhen. Ein interessanter Aspekt, der in diesen Arbeiten untersucht wird, ist die detaillierte Untersuchung aller möglichen Kombinationen von Allelen, die in den PCR-Ergebnissen für einen bestimmten Embryo auftreten können. Die Autoren weisen darauf hin, dass einige der Genotypen, die während der Diagnose erhalten werden können, möglicherweise nicht mit dem erwarteten Muster der verknüpften Marker-Genotypen übereinstimmen, aber dennoch ausreichendes Vertrauen in den nicht betroffenen Genotyp des Embryos bieten. Obwohl diese Modelle beruhigend sind, basieren sie auf einem theoretischen Modell, und im Allgemeinen wird die Diagnose konservativer gestellt, um die Möglichkeit einer Fehldiagnose zu vermeiden. Wenn während der Analyse einer Zelle unerwartete Allele auftreten, wird je nach beobachtetem Genotyp davon ausgegangen, dass entweder eine abnormale Zelle analysiert wurde oder dass eine Kontamination aufgetreten ist und dass keine Diagnose gestellt werden kann. Ein Fall, in dem die Anomalie der analysierten Zelle eindeutig identifiziert werden kann, ist, wenn unter Verwendung einer Multiplex-PCR für verknüpfte Marker nur die Allele eines der Elternteile in der Probe gefunden werden. In diesem Fall kann die Zelle als Monosomie für das Chromosom, auf dem sich die Marker befinden, oder möglicherweise als haploid angesehen werden. Das Auftreten eines einzelnen Allels, das auf einen betroffenen Genotyp hinweist, wird als ausreichend angesehen, um den Embryo als betroffen zu diagnostizieren, und Embryonen, bei denen ein vollständig nicht betroffener Genotyp diagnostiziert wurde, werden für den Ersatz bevorzugt. Obwohl diese Politik zu einer geringeren Anzahl nicht betroffener Embryonen führen kann, die für den Transfer geeignet sind, wird sie der Möglichkeit einer Fehldiagnose vorgezogen.

Präimplantationsgenetische Haplotypisierung