PGD on ennen implantaatiota tehtävä geneettinen diagnoosi. Tämä tarkoittaa, että potilaan varhaismunasolut tulisi hedelmöittää in vitro ja alkiot pitää viljelmässä, kunnes diagnoosi on vahvistettu. On myös tarpeen suorittaa biopsia näistä alkioista, jotta saadaan materiaalia, johon suorittaa diagnoosin. Itse diagnoosi voidaan suorittaa useilla tekniikoilla, riippuen tutkitun tilan luonteesta. Yleensä PCR-pohjaisia menetelmiä käytetään monogeenisiin sairauksiin ja kaloja kromosomipoikkeavuuksiin sekä sukupuolittumiseen niissä tapauksissa, joissa X-linkitetyn taudin PCR-protokollaa ei ole saatavilla. Nämä tekniikat on sovitettava käytettäväksi blastomeereilla, ja ne on testattava perusteellisesti yksisolumalleilla ennen kliinistä käyttöä. Lopuksi, kun alkio on korvattu, hyvälaatuiset, vahingoittumattomat alkiot voidaan kryoparoida, sulattaa ja siirtää takaisin seuraavassa syklissä.

Embryoseditin saaminen

tällä hetkellä kaikki PGD-alkiot saadaan avusteisella lisääntymismenetelmällä, vaikka aiemmin yritettiin käyttää luonnon kiertokulkua ja In vivo-hedelmöitystä, jota seurasi kohdun huuhtelu, ja nyt siitä on suurelta osin luovuttu. Suuren varhaismunasolujen ryhmän saamiseksi potilaille tehdään kontrolloitu munasarjojen stimulaatio (CoH). COH toteutetaan joko agonistiprotokollassa käyttäen aivolisäkkeen desensitisaatioon tarkoitettuja gonadotropiinia vapauttavan hormonin (GnRH) analogeja yhdistettynä ihmisen menopausaalisiin gonadotropiineihin (HMG) tai rekombinantti follikkelia stimuloivaan hormoniin (FSH) tai antagonistiprotokollassa käyttäen rekombinanttia FSH: ta yhdistettynä GnRH-antagonistiin potilaan profiilin kliinisen arvioinnin (ikä, painoindeksi (BMI), endokriiniset parametrit) mukaan. hCG: tä annetaan transvaginaalisessa ultraäänitutkimuksessa, jossa on havaittu vähintään kolme follikkelia, joiden keskimääräinen halkaisija on yli 17 mm. Munasolut kerätään ultraäänitutkimuksella 36 tunnin kuluttua hCG: n antamisesta. Luteaalivaiheen täydentäminen koostuu 600 µg: n luonnollisesta mikronisoidusta progesteronista päivittäisestä intravaginaalisesta antamisesta.

varhaismunasolut denudoidaan huolellisesti cumulus-soluista, koska nämä solut voivat saastua PGD: n aikana, jos käytetään PCR-tekniikkaa. Suurimmassa osassa raportoiduista sykleistä IVF: n sijasta käytetään sytoplasmaista siittiöiden injektiota (ICSI). Tärkeimmät syyt ovat estää saastuminen jäljellä siittiöiden kiinni zona pellucida ja välttää odottamaton lannoitus epäonnistuminen. ICSI-menettely suoritetaan kypsille metafaasi-II-varhaismunasoluille ja hedelmöitys arvioidaan 16-18 tunnin kuluttua. Alkionkehitystä arvioidaan edelleen joka päivä ennen koepalaa ja kunnes se siirretään naisen kohtuun. Pilkkoutumisvaiheessa alkio arvioidaan päivittäin blastomeerien lukumäärän, koon, solumuodon ja sirpaloitumisnopeuden perusteella. Päivänä 4 alkiot pisteytettiin niiden tiivistymisasteen funktiona ja blastokystit arvioitiin throfektodermin ja sisäsolumassan laadun ja laajenemisasteen mukaan.

Biopsiamenetelmät

koska PGD voidaan tehdä eri kehitysvaiheista tuleville soluille, biopsiamenetelmät vaihtelevat vastaavasti. Teoriassa koepala voidaan suorittaa kaikissa preimplantaatiovaiheissa, mutta vain kolmea on ehdotettu: hedelmöittymättömille ja hedelmöityneille varhaismunasoluille (polaarisille elimille, PBs), kolmena päivänä pilkkoutuvaiheen alkioille (blastomeereille) ja blastokysteille (trofektodermisoluille).

biopsiatoimenpiteessä on aina kaksi vaihetta: zona pellucida avataan ja solut poistetaan. On olemassa erilaisia lähestymistapoja molempiin vaiheisiin, mukaan lukien mekaaninen, kemiallinen, ja fyysinen (Tyroden hapan liuos) ja lasertekniikka zona pellucida: n murtamiseen, puristamiseen tai aspiraatioon PBS: n ja blastomeerien poistamiseksi ja trofectodermin solujen herniation.

Polar body biopsyEdit

polar body biopsia on näytteenotto polaarisesta kehosta, joka on pieni haploidi solu, joka muodostuu oogeneesin aikana samanaikaisesti munasoluksi, mutta jolla ei yleensä ole hedelmöityskykyä. Verrattuna blastocystin biopsia, polar kehon biopsia voi mahdollisesti olla alhaisemmat kustannukset, vähemmän haitallisia sivuvaikutuksia, ja herkempi havaita poikkeavuuksia. POLAARIKAPPALEIDEN käytön tärkein etu PGD: ssä on se, että ne eivät ole välttämättömiä onnistuneen hedelmöityksen tai normaalin alkionkehityksen kannalta, jolloin sikiölle ei aiheudu haitallisia vaikutuksia. Yksi PB-koepalan haitoista on se, että se antaa vain tietoa äidin osuudesta alkioon, minkä vuoksi voidaan diagnosoida maternaalisesti periytyviä autosomaalisesti dominoivia ja X-linkittyneitä häiriöitä, jotka ovat yksinomaan emolta periytyviä, ja autosomaalisesti resessiivisiä häiriöitä voidaan diagnosoida vain osittain. Toinen haittapuoli on lisääntynyt diagnostisten virheiden riski, joka johtuu esimerkiksi geneettisen materiaalin hajoamisesta tai rekombinaatiotapahtumista, jotka johtavat heterotsygoottisiin ensimmäisiin polaarisiin kappaleisiin.

Pilkkoutumisvaiheen biopsia (blastomeeribiopsia)Edit

Pilkkoutumisvaiheen biopsia tehdään yleensä kolmannen päivän aamuna hedelmöityksen jälkeen, jolloin normaalisti kehittyvät alkiot saavuttavat kahdeksansoluisen vaiheen. Biopsia tehdään yleensä alkioille, joissa on alle 50% anukleaattisista fragmenteista ja 8-soluisessa tai myöhemmässä kehitysvaiheessa. Zona pellucidaan tehdään reikä ja yksi tai kaksi tuman sisältävää blastomeeria hengitetään tai pursotetaan varovasti aukon läpi.Katkaisuvaiheen biopsian tärkein etu verrattuna PB-analyysiin on se, että molempien vanhempien geneettistä panosta voidaan tutkia. Toisaalta pilkkoutumisvaiheessa olevilla alkioilla on havaittu olevan runsaasti kromosomimosaiikkia, mikä asettaa kyseenalaiseksi sen, ovatko yhdellä vai kahdella blastomeerilla saadut tulokset edustavia alkion muulle osalle. Se on tästä syystä, että jotkut ohjelmat käyttävät yhdistelmä PB biopsia ja blastomere biopsia. Lisäksi pilkkoutumisvaiheen biopsiassa, kuten PB-biopsiassa, saadaan hyvin rajallinen määrä kudosta diagnoosia varten, mikä edellyttää yksisoluisen PCR-ja KALATEKNIIKAN kehittämistä.Vaikka teoriassa PB-koepala ja blastokystabiopsia ovat vähemmän haitallisia kuin pilkkoutumisvaiheen koepala, tämä on edelleen vallitseva menetelmä. Sitä käytetään noin 94 prosentissa ESHRE: n PGD-konsortiolle raportoiduista PGD-sykleistä. Tärkeimmät syyt ovat, että se mahdollistaa turvallisemman ja täydellisemmän diagnoosin kuin PB-biopsia ja jättää silti riittävästi aikaa diagnoosin loppuun ennen kuin alkiot on vaihdettava potilaan kohtuun, toisin kuin blastokystibiopsia.Kaikista pilkkoutumisvaiheista on yleisesti sovittu, että optimaalinen hetki koepalalle on kahdeksansoluisessa vaiheessa. Se on diagnostisesti turvallisempi kuin PB-koepala, ja toisin kuin blastokystibiopsia, se mahdollistaa alkioiden diagnosoinnin ennen 5.päivää. Tässä vaiheessa solut ovat vielä totipotentteja eivätkä alkiot vielä tiivisty. Vaikka on osoitettu, että jopa neljännes ihmisalkiosta voidaan poistaa häiritsemättä sen kehitystä, on vielä tutkittava, korreloiko koepala yhdestä vai kahdesta solusta alkion kykyyn kehittyä edelleen, istuttaa ja kasvaa täysiaikaiseksi raskaudeksi.

kaikilla zona pellucidan avausmenetelmillä ei ole samaa onnistumisprosenttia, koska biopsiassa käytetty menetelmä voi vaikuttaa alkion ja / tai blastomeerin hyvinvointiin. Zona poraus acid Tyrode n ratkaisu (ZD) tarkasteltiin verrattuna osittainen zona dissektio (PZD) määrittää, mikä tekniikka johtaisi onnistuneempia raskauksia ja on vähemmän vaikutusta alkion ja/tai blastomere. ZD käyttää ruoansulatusentsyymiä kuten pronaasia, mikä tekee siitä kemiallisen porausmenetelmän. ZD: ssä käytetyt kemikaalit voivat vahingoittaa alkiota. PZD käyttää lasi microneedle leikata zona pellucida, mikä tekee siitä mekaanisen dissektiomenetelmä, joka yleensä tarvitsee ammattitaitoisia käsiä suorittaa menettelyn. Tutkimuksessa, johon osallistui 71 paria, ZD tehtiin 26 syklissä 19 parilta ja PZD 59 syklissä 52 parilta. Yksisoluanalyysissä PZD-ryhmässä onnistumisprosentti oli 87,5% ja ZD-ryhmässä 85,4%. Äidin ikä, haettujen varhaismunasolujen määrä, hedelmöitysnopeus ja muut muuttujat eivät poikenneet toisistaan ZD-ja PZD-ryhmien välillä. Todettiin, että PZD johti merkitsevästi suurempaan raskauteen (40, 7% vs 15, 4%), jatkuvaan raskauteen (35, 6% vs 11, 5%) ja implantaatioon (18, 1% vs 5, 7%) kuin ZD. Tämä viittaa siihen, että PZD: n mekaanisen menetelmän käyttäminen blastomeren koepaloissa geneettisen diagnoosin esiimplantaatiota varten voi olla taitavampaa kuin ZD: n kemiallisen menetelmän käyttö. PZD: n onnistuminen ZD: n suhteen voi johtua siitä, että ZD: n sisältämällä kemiallisella aineella on haitallinen vaikutus alkioon ja/tai blastomeeriin. Tällä hetkellä zona poraus laserilla on hallitseva tapa avata zona pellucida. Laserin käyttö on helpompi tekniikka kuin mekaanisten tai kemiallisten keinojen käyttö. Laserporaus voi kuitenkin olla haitallista alkiolle ja koeputkihedelmöityslaboratorioiden on erittäin kallista käyttää erityisesti silloin, kun PGD ei ole vallitseva prosessi nykyaikana. PZD voisi olla varteenotettava vaihtoehto näille asioille.

Blastocystin biopsyEdit

yksisolutekniikoihin liittyvien vaikeuksien voittamiseksi on ehdotettu alkioiden koepalaa blastokystavaiheessa, jolloin saadaan suurempi määrä lähtöainetta diagnoosia varten. On osoitettu, että jos samassa näyteputkessa on enemmän kuin kaksi solua, yksisoluisen PCR: n tai kalojen suurimmat tekniset ongelmat poistuisivat käytännössä kokonaan. Toisaalta, kuten pilkkoutumisvaiheen koepalan tapauksessa, kromosomierot sisäsolumassan ja trofektodermin (TE) välillä voivat vähentää diagnoosin tarkkuutta, vaikka tämän mosaiikin on raportoitu olevan pienempi kuin pilkkoutumisvaiheen alkioilla.

te-koepalan on osoitettu onnistuneen eläinmalleissa, kuten kaniineilla, hiirillä ja kädellisillä. Nämä tutkimukset osoittavat, että joidenkin TE-solujen poistuminen ei ole haitallista alkion in vivo-kehitykselle.

ihmisen blastokystavaiheen biopsia PGD: stä tehdään tekemällä reikä ZP: hen in vitro-viljelyn kolmantena päivänä. Tämä mahdollistaa kehittyvän TE: n työntymisen blastulaation jälkeen, mikä helpottaa koepalan ottamista. Viidentenä päivänä hedelmöityksen jälkeen noin viisi solua poistetaan TE: stä lasineulalla tai laserenergialla, jolloin alkio jää suurelta osin ehjäksi ja ilman sisäsolumassan menetystä. Diagnoosin jälkeen alkiot voidaan vaihtaa saman syklin aikana tai kryopreservoida ja siirtää seuraavassa syklissä.

tässä lähestymistavassa on kaksi haittapuolta, jotka johtuvat sen suoritusvaiheesta. Ensinnäkin vain noin puolet preimplantaation alkioista saavuttaa blastokystavaiheen. Tämä voi rajoittaa biopsiaan käytettävissä olevien blastokystien määrää, mikä rajoittaa joissakin tapauksissa PGD: n onnistumista. Mc Arthur ja työkaverit kertovat, että 21 prosentissa aloitetuista PGD-jaksoista ei ollut TE-biopsiaan sopivaa alkiota. Tämä luku on noin neljä kertaa suurempi kuin ESHRE: n PGD-konsortion tietojen keskiarvo, jossa PB-ja pilkkoutumisvaiheen biopsia ovat vallitsevia raportoituja menetelmiä. Toisaalta biopsian lykkääminen näin myöhäiseen kehitysvaiheeseen rajoittaa geneettisen diagnoosin tekemiseen kuluvaa aikaa, mikä vaikeuttaa PCR: n toisen kierroksen uusimista tai kalojen koettimien rehybridisointia ennen kuin alkiot siirretään takaisin potilaaseen.

Cumulus-solunäytteenotto

cumulus-soluista voidaan suorittaa polaaristen kappaleiden tai solujen näytteenoton lisäksi alkiosta. Cumulus-solujen ja munasolun molekulaaristen interaktioiden vuoksi cumulus-solujen geeniekspressioprofiloinnilla voidaan arvioida munasolun laatua ja munasarjojen hyperstimulaatioprotokollan tehokkuutta, ja se voi epäsuorasti ennustaa aneuploidiaa, alkionkehitystä ja raskaustuloksia.

noninvasiiviset Preimplantaatiomenetelmät (NIPGS)Edit

perinteinen alkiobiopsia voi olla invasiivinen ja kallis. Siksi tutkijat ovat jatkuvasti pyrkimys löytää vähemmän invasiivisia menetelmiä preimplantaatio geneettinen testaus. Tutkimukset uusista noninvasiivisista preimplantaatiogeneettisistä seulontamenetelmistä, kuten blastocoel-nesteestä ja käytetyistä alkioalustoista, on äskettäin julkaistu vaihtoehtona perinteisille

Preimplantaatiota edeltävistä geneettisistä Seulontamenetelmistä, joissa käytetään Blastocoel-nestettä (BF)normaalin IVF-prosessin aikana. Vitrifikaatioprosessin aikana kehittynyt räjähdys kuivuu ja se ja sen blastocoel-ontelo luhistuvat jäätymistä varten. On olemassa monia menetelmiä, joita on käytetty helpottamaan romahdusta, mukaan lukien laserpulssi, toistuva mikropipetting, mikroneedle punktio tai mikroimu normaalisti tämä neste olisi sitten hylättävä, mutta preimplantaatio geneettinen testaus BL, tämä neste tallennetaan ja sitten testataan DNA. Tämän DNA: n arvellaan olevan peräisin soluista, jotka ovat käyneet läpi apoptoosin, joka löytyy kehittyvästä alkiosta

Preimplantaatio-geneettinen testaus Blastokystiviljelmän Ehdollistetulla väliaineella (Bccm). toinen menetelmä vähemmän invasiiviseen preimplantaatiota edeltävään geneettiseen testaukseen liittyy alkion kehittämän viljelyaineen testaaminen. On huomattu, että alkio vapauttaa DNA-fragmentteja niistä soluista, jotka ovat kuolleet itämisajan kuluessa. Tällä tiedolla tutkijat ovat järkeilleet, että he voisivat eristää tämän DNA: n ja käyttää sitä preimplantaatiota edeltävään geneettiseen testaukseen

vähemmän invasiivisen preimplantaatiota edeltävän geneettisen testauksen hyödyt ja seuraukset, vaikka on ristiriitaista näyttöä siitä, ovatko perinteisemmät preimplantaatiota edeltävät geenitestausmenetelmät haitallisia alkiolle, on uudempia menetelmiä vähemmän invasiivisiin ja yhtä tehokkaisiin testausmenetelmiin. Tämän vuoksi olemme siirtyneet preimplantaatiogeenisiin testeihin, joissa käytetään blastocoel-nestettä ja käytettyjä alkionesteitä. Yksi ongelma näissä vaihtoehdoissa on se, että DNA: ta on mahdollisimman vähän. Toinen erittäin tärkeä kysymys on, onko tämä tekniikka tarkka vai ei. Molempia huolia Kuznyetsov käsitteli hiljattain. Kuznyetsov päätti käyttää molempia menetelmiä yhdistämällä molemmista tekniikoista haetun DNA: n määrän. Kun DNA oli eristetty, sitä käytettiin geneettiseen testaukseen. Tulokset osoittivat, että kun molempia menetelmiä Blastokystinestettä ja alkioiden käytettyä Väliainetta käytettiin yhdessä, koko kromosomikopion vahvistusnopeus oli 87.5% verrattuna trophectoderm, 96,4% verrattuna koko Blastocyst (kultakanta). Lisäksi amplifioinnin jälkeen tällä uudella menetelmällä he pystyivät tuottamaan 25.0-54.0 ng/ul DNA: ta näytettä kohti. Perinteisillä menetelmillä, kuten trofectodermin, he keräsivät 10-44 ng/ul

geneettisen analyysin tekniikoilla edit

fluoresoiva in situ hybridisaatio (FISH) ja polymeraasiketjureaktio (PCR) ovat kaksi yleisesti käytettyä ensimmäisen sukupolven teknologiaa PGD: ssä. PCR: ää käytetään yleensä monogeenisten häiriöiden diagnosointiin ja FISH: ia kromosomipoikkeavuuksien toteamiseen (esimerkiksi aneuploidian seulonta tai kromosomien translokaatiot). Viime vuosina PGD-testauksen erilaiset edistysaskeleet ovat mahdollistaneet käytettävissä olevien tulosten kattavuuden ja tarkkuuden parantamisen käytetystä teknologiasta riippuen. Äskettäin kehitettiin menetelmä, joka mahdollistaa metafaasilevyjen korjaamisen yksittäisistä blastomeereistä. Tämä tekniikka yhdessä kalojen kanssa, m-FISH voi tuottaa luotettavampia tuloksia, koska analyysi tehdään kokonaisille metafaasilevyille

kalan ja PCR: n lisäksi kokeillaan yksisoluisen genomin sekvensointia geenidiagnoosin preimplantointimenetelmänä. Tämä luonnehtii alkion perimän täydellistä DNA-sekvenssiä.

FISHEdit

FISH on yleisimmin käytetty menetelmä alkion kromosomirakenteen määrittämiseksi. Karyotyypityksestä poiketen sitä voidaan käyttää interfaasikromosomeissa, jolloin sitä voidaan käyttää PBs -, blastomeerit-ja TE-näytteissä. Solut kiinnittyvät lasimikroskoopin dioihin ja hybridisoituvat DNA-antureilla. Jokainen näistä koettimista on spesifinen kromosomin osalle, ja ne on merkitty fluorokromilla.

Kaksoiskalojen katsottiin olevan tehokas menetelmä ihmisen esiimplantaation alkioiden sukupuolen määrittämiseen ja ylimääräiseen kykyyn havaita epänormaaleja kromosomikopioiden lukumääriä, mikä ei ole mahdollista polymeraasiketjureaktion (PCR) avulla.

tällä hetkellä kaikkien kromosomien eri lohkoille on saatavilla suuri anturipaneeli, mutta eri fluorokromien rajallinen määrä rajoittaa signaalien määrää, jotka voidaan analysoida samanaikaisesti.

näytteessä käytettävien antureiden tyyppi ja lukumäärä riippuu käyttöaiheesta. Sukupuolen määrittämiseen (käytetään esimerkiksi silloin, kun PCR-protokollaa tietylle X-linkittyneelle häiriölle ei ole saatavilla) käytetään X-ja Y-kromosomien koettimia yhdessä yhden tai useamman autosomien koettimien kanssa kalan sisäisenä kontrollina. Lisää koettimia voidaan lisätä aneuploidioiden tarkistamiseksi, erityisesti ne, jotka voivat aiheuttaa elinkelpoisen raskauden (kuten trisomia 21). Kromosomien X, Y koettimien käyttö, 13, 14, 15, 16, 18, 21 ja 22 on mahdollisuus havaita 70% aneuploidies löytyy spontaaneja abortteja.

jotta samasta näytteestä pystytään analysoimaan useampia kromosomeja, voidaan tehdä enintään kolme peräkkäistä kalakierrosta. Kromosomien uudelleenjärjestelyissä on valittava erityisiä koettimien yhdistelmiä, jotka kiertävät kiinnostavan alueen. KALATEKNIIKASSA virhetasoksi katsotaan 5-10 prosenttia.

kalojen käytön suurin ongelma alkioiden kromosomirakentamisen tutkimisessa on ihmisen preimplantaatiovaiheessa havaittu kohonnut mosaiikkinopeus. Yli 800 alkiota käsittäneessä meta-analyysissä päädyttiin tulokseen, että noin 75% esiimplantoiduista alkioista on mosaiikkia, josta noin 60% on diploidi–aneuploidista mosaiikkia ja noin 15% aneuploidista mosaiikkia. Li ja työtoverit havaitsivat, että 3.päivänä aneuploidiksi diagnosoiduista alkioista 40% osoittautui euploidiseksi sisäsolumassaksi 6. päivänä. Staessen ja yhteistyökumppanit havaitsivat, että 17,5% alkioista, jotka todettiin epänormaaleiksi PGS: n aikana ja joille tehtiin PGD: n jälkeinen uudelleenanalyysi, sisälsi myös normaaleja soluja, ja 8,4%: n todettiin olevan täysin normaaleja. Tämän vuoksi on kyseenalaistettu, edustavatko alkiosta tutkitut yksi tai kaksi solua todella kokonaista alkiota ja hylätäänkö elinkykyisiä alkioita tekniikan rajoitusten vuoksi.

PCREdit

Kary Mullis keksi PCR: n vuonna 1985 DNA: n replikaation in vitro-yksinkertaistettuna reproduktiona. DNA: n kemiallisia ominaisuuksia ja termostabiilien DNA-polymeraasien saatavuutta hyödyntäen PCR mahdollistaa DNA-näytteen väkevöinnin tietyssä järjestyksessä. PCR: n avulla on mahdollista saada suuri määrä kopioita tietystä genomin osasta, mikä mahdollistaa tarkemman analyysin. Se on erittäin herkkä ja erityinen teknologia, joka tekee siitä sopivan kaikenlaisiin geneettisiin diagnooseihin, myös PGD: hen. Tällä hetkellä PCR: stä itsestään sekä PCR-tuotteiden jälkianalyysimenetelmistä on olemassa monia erilaisia variaatioita.

käytettäessä PCR: ää PGD: ssä esiintyy ongelma, joka on rutiininomaisessa geneettisessä analyysissä olematon: käytettävissä olevan genomisen DNA: n vähäiset määrät. Koska PGD suoritetaan yksittäisille soluille, PCR on mukautettava ja työnnettävä fyysisiin rajoihinsa ja käytettävä mahdollisimman vähän mallia: joka on yksi säie. Tämä edellyttää PCR-olosuhteiden pitkää hienosäätöä ja alttiutta kaikille perinteisen PCR: n ongelmille, mutta useita asteita voimistunut. Tarvittavien PCR-syklien suuri määrä ja mallin rajallinen määrä tekevät yksisoluisesta PCR: stä erittäin herkän kontaminaatiolle. Toinen yksisoluiselle PCR: lle ominainen ongelma on alleeli drop out (ADO)-ilmiö. Se koostuu yhden heterotsygoottisessa näytteessä esiintyvän alleelin satunnaisesta vahvistamattomuudesta. ADO vaarantaa vakavasti PGD: n luotettavuuden, koska heterotsygootti alkio voidaan diagnosoida vaikuttuneeksi tai muuttumattomaksi riippuen siitä, mikä alleeli ei vahvistuisi. Tämä koskee erityisesti PGD: tä autosomissa vallitsevissa häiriöissä, joissa sairastuneen alleelin ADO voisi johtaa sairastuneen alkion siirtoon.

Useita PCR-pohjaisia määrityksiä on kehitetty eri sairauksille, kuten myotoniseen dystrofiaan ja fragile X: ään liittyville triplet-toistogeeneille yksittäisissä ihmisen somaattisissa soluissa, sukusoluissa ja alkioissa.

NGSEdit

vuodesta 2014 lähtien PGT: ssä suoritetaan seuraavan sukupolven sekvensointia (next generation sequencing, NGS). NGS, joka tunnetaan myös nimellä massive parallel sequencing, on joukko tekniikoita, jotka pystyvät sekvensoimaan suuria määriä DNA: ta kohtuullisin kustannuksin ja aikaan. Se voi antaa meille yleisen näkökulman koko alkion genomiin, myös mitokondrioon. Nämä tekniikat perustuvat sekvensointi lyhyt lukee noin 400 emäkset kunkin ja päällekkäisiä nämä lukee tehokas kohdistus ohjelmisto.

samoin NGS: n avulla voidaan havaita myös aneuploidiat 24 kromosomissa ja yhden geenin viat, kun kantajavanhemmilta on saatu viitteitä. Tärkein etu on se, että NGS voi yhdistää sekä aneuploidioiden että monogeenisten sairauksien havaitsemisen yhdellä koepalalla ja on alentanut edullisia kustannuksia, mikä tekee siitä helpommin saatavilla.

kaksi esimerkkiä NGS: stä ovat pyrosekvenssi ja reversiibeli väriaineen terminaattori.

diagnostisointi

diagnoosin tekeminen PGD: ssä ei ole aina yksinkertaista. Kalojen tai PCR-tulosten jälkeen korvattavien alkioiden valinnassa käytetyt kriteerit eivät ole kaikissa keskuksissa yhtäläiset.Kalojen osalta joissakin keskuksissa korvataan vain alkioita, joiden on todettu olevan kromosomaalisesti normaaleja (eli joissa on kaksi signaalia gonosomien ja analysoitujen autosomien osalta) yhden tai kahden blastomeerin analyysin jälkeen, ja kun analysoidaan kahta blastomeeria, tulosten on oltava yhteneväisiä. Toiset keskukset väittävät, että monosomisiksi diagnosoidut alkiot voitaisiin siirtää, koska väärä monosomia (eli yhden kalan signaalin menetys normaalissa diploidisessa solussa) on useimmin esiintyvä väärä diagnoosi. Tällöin aneuploidisen raskauden riskiä ei ole, eikä normaaleja diploidisia alkioita menetetä siirrettäväksi KALAVIRHEEN vuoksi. Lisäksi on osoitettu, että alkiot, jotka on diagnosoitu monosomisiksi 3.päivänä (lukuun ottamatta kromosomeja X ja 21), eivät koskaan kehity blastokystiksi, mikä korreloi siihen, että näitä monosomeja ei koskaan havaita jatkuvissa raskauksissa.

diagnoosi ja väärä diagnoosi PGD: ssä PCR: ää käyttäen on matemaattisesti mallinnettu Navidin ja Arnheimin sekä Lewisin ja yhteistyökumppaneiden työssä. Näiden julkaisujen tärkein johtopäätös on, että alkion tehokas ja tarkka diagnosointi edellyttää kahta genotyyppiä. Tämä voi perustua yksittäisen solun merkkiaineeseen ja taudin genotyyppeihin tai kahden solun merkkiaineeseen/taudin genotyyppiin. Mielenkiintoinen näkökohta tutkitaan näissä asiakirjoissa on yksityiskohtainen tutkimus kaikista mahdollisista yhdistelmistä alleelit, jotka voivat näkyä PCR tulokset tietyn alkion. Kirjoittajat osoittavat, että jotkut genotyypit, jotka voidaan saada diagnoosin aikana ei ehkä ole sopusoinnussa odotetun mallin linkitettyjen merkkigenotyyppien, mutta ovat silti riittävän luottamuksen siitä, että muuttumaton genotyyppi alkion. Vaikka nämä mallit ovat rauhoittavia, ne perustuvat teoreettiseen malliin, ja yleensä diagnoosi tehdään konservatiivisemmalla pohjalla, tavoitteena välttää väärien diagnoosien mahdollisuus. Kun solun määrityksessä ilmenee odottamattomia alleeleja havaitusta genotyypistä riippuen, katsotaan, että joko epänormaali solu on analysoitu tai kontaminaatio on tapahtunut eikä diagnoosia voida vahvistaa. Jos analysoidun solun poikkeavuus voidaan selvästi tunnistaa, näytteestä löytyy multiplex PCR: ää käyttäen vain jommankumman vanhemman alleelit. Tällöin solun voidaan katsoa kantavan monosomia sille kromosomille, jolla markkerit sijaitsevat, tai mahdollisesti haploidina. Yhden alleelin ilmaantumista, joka osoittaa sairastuneen genotyypin, pidetään riittävänä diagnosoimaan alkio sairaaksi, ja alkioita, joilla on diagnosoitu täysin muuttumaton genotyyppi, suositellaan korvattavaksi. Vaikka tämä käytäntö voi johtaa siihen, että siirrettäviksi soveltuvien, vahingoittumattomien alkioiden määrä on pienempi, sitä pidetään parempana kuin mahdollista virheellistä diagnoosia.

Preimplantation genetic haplotypingEdit

preimplantaatio geneettinen haplotypointi (PGH) on PGD-tekniikka, jossa tunnistetaan geneettisten markkereiden haplotyyppi, jolla on tilastollinen yhteys kohdesairauteen, eikä taudin aiheuttava mutaatio.

kun tietylle taudille on määritetty geenimerkkipaneeli, sitä voidaan käyttää kaikille kyseisen taudin kantajille. Sen sijaan koska monogeenisenkin sairauden voivat aiheuttaa monet eri mutaatiot kyseisen geenin sisällä, tavanomaiset tietyn mutaation löytämiseen perustuvat PGD-menetelmät vaatisivat mutaatiospesifisiä testejä. Näin ollen PGH laajentaa PGD: n saatavuutta tapauksiin, joissa mutaatiospesifisiä testejä ei ole saatavilla.

PGH: n etuna kaloihin nähden on myös se, että kalat eivät yleensä pysty erottamaan alkioita, joilla on kromosomin translokaation tasapainoinen muoto, ja alkioita, joilla on homologisia normaalikromosomeja. Tämä kyvyttömyys voi olla vakavasti haitallista tehdyn diagnoosin. PGH voi tehdä eron, johon kalat eivät useinkaan pysty. PGH tekee tämän käyttämällä polymorfisia markkereita, jotka soveltuvat paremmin translokaatioiden tunnistamiseen. Nämä polymorfiset markkerit pystyvät erottamaan alkiot, jotka kuljettivat normaaleja, tasapainoisia ja epätasapainoisia translokaatioita. FISH vaatii myös enemmän solunsidontaa analysointia varten, kun taas PGH vaatii vain solujen siirtämistä polymeraasiketjureaktioputkiin. Solun siirto on yksinkertaisempi menetelmä ja jättää vähemmän tilaa analyysin epäonnistumiselle.

alkionsiirto ja ylimääräisten embryosEdit

alkionsiirto tehdään yleensä kolmantena tai viidentenä päivänä hedelmöityksen jälkeen, ajoitus riippuu PGD: n käytössä olevista tekniikoista ja IVF-Keskuksen vakiomenetelmistä.

kun Euroopassa on otettu käyttöön yhden alkion siirtopolitiikka, jonka tavoitteena on vähentää monisikiöraskauksien ilmaantuvuutta avusteisten lisääntymismenetelmien jälkeen, kohdussa korvataan yleensä yksi alkio tai varhainen blastokysti. Seerumin hCG määritetään 12. päivänä. Jos raskaus todetaan, suoritetaan ultraäänitutkimus 7 viikon kuluttua sikiön sydämen sykkeen toteamiseksi. Pariskuntia kehotetaan yleensä käymään PND: ssä, koska väärien diagnoosien riski on pieni.

ei ole epätavallista, että PGD: n jälkeen on enemmän alkioita, jotka soveltuvat siirrettäväksi takaisin naiselle kuin on tarpeen. PGD: n läpikäyville pareille nämä alkiot ovat erittäin arvokkaita, sillä parin nykyinen sykli ei välttämättä johda jatkuvaan raskauteen. Alkion kryopreservointi ja myöhemmin sulattaminen ja korvaaminen voivat antaa heille uuden mahdollisuuden raskauteen ilman, että heidän tarvitsee tehdä uudelleen hankalia ja kalliita ART-ja PGD-menettelyjä.