välilevyn rappeumaa on yleinen vaiva, johon liittyy useita monitekijöitä. 1 matala-asteisen infektion on ehdotettu aiheuttavan disc degeneration Propionibacterium akne tunnistettu 84% potilaista, joilla levy herniation ja iskias käyttäen serologiaa ja viljelmiä. 2 myös Molekyylimuutoksia on havaittu, kuten katabolisten entsyymien (katepsiini, lysotsyymi ja useat matriisimetalloproteinaasit) ja tulehduksellisten sytokiinien lisääntynyt tuotanto. 3 nuoret potilaat, joilla oli lannerangan välilevyn herniatio, paranivat heikommin leikkauksen jälkeen, kun heillä oli ollut kohonnut seerumin korkean herkkyyden C-reaktiivisen proteiinin (hs-CRP) pitoisuus ennen leikkausta. Ei kuitenkaan ole selvää, kertovatko CRP: n ja tulehduksellisten sytokiinien korkeat pitoisuudet paikallisesta infektiosta vai välilevytyrän aiheuttamasta tulehdusreaktiosta. 4

taudinaiheuttajilla, kuten Parvoviruksella B19 tai Epstein Barr-viruksella (EBV), on tärkeä rooli niveltulehduksen eri muotojen patogeneesissä. 5,6 herpesvirukset ovat monipuolinen perhe suuria DNA-viruksia, jotka kaikki voivat luoda elinikäisiä piileviä infektioita. Ensisijainen infektio monet näistä viruksista on yleinen lapsuudessa. 7,8

tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tutkia herpesvirusten, Herpes Simplex-viruksen tyypin 1(HSV-1), Herpes Simplex-viruksen tyypin 2 (HSV-2) ja sytomegaloviruksen (CMV) mahdollista osuutta nikamavälilevyn rappeuman patogeneesissä. Molekyylianalyysi välilevynäytteistä, jotka otettiin discektomian aikana, osoitti, että CMV: n ja HSV-1: n DNA: n esiintymistiheys degeneroituneissa välilevyissä oli huomattava, mikä viittaa siihen, että virusinfektiot saattavat olla tärkeä tekijä tämän taudin etiologiassa.

potilaat ja menetelmät

tutkittiin yhteensä 16 peräkkäistä potilasta, joille tehtiin diskektomia kuuden kuukauden kuluessa lannerangan välilevyn herniaatiosta. Mukana oli kahdeksan miestä ja kahdeksan naista, joiden keski-ikä oli 40,38 vuotta (17-65). Tutkimuksella oli eettinen hyväksyntä. Lannerangan välilevyn herniation diagnosoitiin lääkärintarkastuksella ja magneettikuvauksella. Kontrolliryhmän saamiseksi välilevynäytteet otettiin perkutaanisesti kahdelta leikkauksessa olleelta thoracolumbar-murtumapotilaalta. Näille potilaille tehtiin myös magneettikuvaus ennen leikkausta samanaikaisen degeneraation poissulkemiseksi. Tässä tutkimuksessa testattujen näytteiden luonne ei eettisistä syistä mahdollistanut useamman välilevyn ottamista terveiltä henkilöiltä, kun taas ruumiinnäytteiden vaihtoehdosta verrokkina luovuttiin, koska suurimmalla osalla aikuisväestöstä on todettu alaselkäkipuja ja välilevyn rappeutumista.

jokaiselta potilaalta otettiin perifeerisen verinäytteen lisäksi välilevynpoistoleikkauksen yhteydessä saatu materiaali. Kudosnäytteet sijoitettiin steriloituun polypropeeniin 1.5 ml: n putkia ja säilytettiin -80°C: ssa, kunnes suoritettiin DNA/RNA-uutto ja polymeraasiketjureaktio/ kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio (PCR/qRT-PCR). HSV-1: n ja CMV: n, IgM+: n ja IgG+: n vasta-aineiden osoittamisessa plasmasta käytettiin standardia entsyymi-immunomääritystä.

DNA / RNA-uutto.

kudosnäytteistä erotettiin genominen DNA ja kokonais-RNA käyttäen NucleoSpin Tissue XS kit ja NucleoSpin RNA XS kit (Macherey-Nagel GmbH and Co., Düren, Saksa) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Puhdistettua RNA: ta käsiteltiin edelleen DNASEI-valmisteella DNA-kontaminaation välttämiseksi. DNA-ja RNA-näytteiden pitoisuudet määritettiin spektrofotometrillä (260 nm) ennen PCR-monistusta tai qRT-PCR: ää.

herpesvirusten DNA: n osoittaminen.

testasimme kahdeksaa eri herpesvirusta (HSV-1 / -2, Varicella Zoster-Virus (VZV), EBV, CMV, ihmisen herpesvirukset 6, 7 ja 8 (HHV6, HHV7 ja hhv8) RhyMA Test-Herpesseulonnalla valmistajan ohjeiden mukaisesti (Euroclone, Pavia, Italia). RhyMA-testi perustui käänteiseen Hybridisaatioteknologiaan, jossa multiplex – DNA monistetaan PCR: llä spesifisillä biotinyloiduilla alukkeilla, minkä jälkeen monistetut ja biotinyloidut DNA-fragmentit hybridisoitiin kullekin herpesvirukselle ominaisilla koettimilla olevilla liuskoilla. Tulosten arviointiin tarvittiin lopullinen kehittyvä reaktio biotiini-streptavidiinijärjestelmän avulla. Jokaiseen nauhaan sisältyi myös positiivinen-ja vahvistuskontrolli. Tulosten tulkintaa varten kunkin näytteen kehittynyt kaistale mukautettiin vakiotaulukkoon. RhyMA Test-Herpes-seulonta on lisensoitu in vitro-diagnostiikkaan, mikä todistaa määrityksen suuren spesifisyyden ja herkkyyden. RhyMA Test-Herpes screening assay-menetelmällä saatujen tulosten todentamiseksi PCR-tuotteet testattiin myös 3-prosenttisessa, heikosti sulavassa agaroosigeelissä, joka tuotti kullekin virukselle odotetun elektroforeettisen kuvion. Lopuksi PCR-positiivisille näytteille tehtiin suora sekvensointianalyysi, joka vahvisti RhyMA Test-Herpes screening assay-menetelmällä saadut tulokset.

HSV-1 ja CMV qRT-PCR.

Total RNA: n käänteiskopioinnissa käytettiin RETROSKRIPTIOPAKETTIA (Ambion Inc., Austin, Texas, USA) satunnaisilla hexamer-alukkeilla. cDNAs-standardien laatua testattiin muodostamalla standardikäyrät käyttämällä kunkin cDNA: n sarjalaimennoksia malleina qRT-PCR-standardeissa. CDNA-malleilla määrityksen hyötysuhde oli 90-105%, ja kaikkien vakiokäyrien R2 oli > 0,98. Käänteisen transkription jälkeen cdnat monistettiin käyttämällä ICP0-ja IE1-spesifisiä alukkeita HSV-1-ja HCMV-mRNAs-arvojen kvantifiointiin, kuten edellä on kuvattu. 9,10

kaikki qRT-PCR: t suoritettiin kolmena kappaleena käyttäen Maxima SYBR Green qPCR master mixiä (Fermentas Inc., Glen Burnie, Maryland) ABI PRISM 7500-Sekvenssianturissa (PE Biosystems, Foster City, Kanada), mukaan lukien uutetut RNA-näytteet sekä positiiviset ja negatiiviset kontrollit. SYBR vihreä fluoresenssi mitattiin 40 vahvistussyklin aikana. Kullekin kvantifioidulle mallille laskettiin syklin keskiarvo, jolla tuotteen kertymä tuli lineaariselle alueelle (CT). Toistetut CT-arvot olivat 0, 4 syklin sisällä toisistaan. Tietyn mallin 18SRRNA CT-arvo vähennettiin kunkin mRNA: n (ICP0 ja IE1) osalta samasta lomakkeesta saadusta CT-arvosta, jotta kullekin lomakkeelle saatiin normalisoitu CT-arvo (ΔCT).

tuumorinekroositekijä-α ja interleukiini-6-geenin ilmentyminen.

TNF-α: n tai IL-6 mRNA: n kvantifiointiin käytettiin 1 µl cDNA: ta yhdessä edellä mainittujen alukkeiden kanssa 20 µl: n reaktiossa käyttäen SYBR Greeniä DNA-pitoisuuden merkkiaineena. Käytetyt alukkeet olivat: beta actin: Forward: 5 ’- TCAGAAGAACTC CTA TGT GG-3’, Reverse: 5 ’- TCT CTT TGA TGT CAC GCA CG-3′; TNF-a Forward: 5′-CAC GCT CTT CTG TCT ACT GAA CTT CG-3′, Reverse: 5′-GGC TGG GTA gag AAT GGA TGA ACA CC-3′, 11 IL-6: Forward: 5′-ACA GCC ACT CAC CTC TTC AG -3′, Reverse: 5′ – GTG CCT CTT TGC TGC TTT CAC -3’. 12 reaktiossa ei esiintynyt sivutuotteita, kuten reaktion lopussa annettu dissosiaatiomalli ja agaroosigeelielektroforeesi osoittavat (tietoja ei näy). TNF-α: n ja IL-6: n tuotteiden monistustehokkuus oli sama kuin beeta-aktiinilla vahvistuksen standardikäyrien osoittamana, jolloin voidaan käyttää kaavaa: kertakorotus = 2–(ΔCt a-ΔCtB). Reaktiot suoritettiin kolmena kappaleena tilastollisen arvioinnin mahdollistamiseksi.

tulokset

PCR–käänteistä hybridisaatiomääritystä käytettiin seulomaan kahdeksan eri herpesviruksen DNA: ta välilevynäytteistä potilailla, joilla oli välilevyn herniatio (Kuva. 1). Herpesviruksen DNA: ta havaittiin 13: lla 16 näytteestä (81,25%). HSV-1: n esiintyvyys oli suurin yhdeksällä potilaalla (56, 25%), kun taas CMV todettiin kuudella potilaalla (37, 5%) (Taulukko I). Kahdella potilaalla oli samanaikaisesti sekä HSV-1-että CMV-infektio. HSV-2: n, VZV: n, EBV: n, HHV6: n, HHV7: n ja HHV8: n DNA: ta ei havaittu yhdenkään potilaan levynäytteissä. Kummallakaan kontrollipotilaalla (C1 ja C2) ei todettu herpesviruksen DNA: ta (Kuva. 1).

HSV-1-ja CMV-infektion tila välilevynäytteissä tutkittiin tutkimalla viruksen transkriptien mahdollista ilmentymistä reaaliaikaisella qRT-PCR: llä. Herpesviruksen geeniekspressiota ei havaittu yhdessäkään testatuista näytteistä, mikä osoittaa aktiivisen virusinfektion puuttumisen, mikä viittaa latentin herpesvirusinfektion muodostumiseen näissä näytteissä.

myös potilaiden seropositiivisuutta tutkittiin. Kaikilla PCR-positiivisilla HSV-1-tai CMV-positiivisilla potilailla esiintyi IgG+ – vasta-aineita samalle virukselle (taulukko I). Kolmessa HSV-1-tapauksessa ja kuudessa CMV-tapauksessa todettiin IgG+ – vasta-aineita ilman viruksen DNA: n samanaikaista esiintyvyyttä. Lisäksi perifeerisen veren HSV-1-ja CMV IgM+ – vasta-aineet olivat negatiivisia kaikilla potilailla, mikä viittaa siihen, ettei kenelläkään potilaista ollut ollut akuuttia herpesvirusinfektiota leikkauksen yhteydessä.

herniated-levyä ympäröivän tulehduksen makroskooppisen viittauksen lisäksi saimme kokeellista näyttöä myös välilevyn tulehduksesta tutkimalla TNF-α: n ja IL-6: n mRNA-pitoisuuksia kaikissa näytteissä qRT-PCR: llä. Analyysi osoitti noin kaksin-kolminkertainen nousu molempien tulehdusmerkkiaineiden näytteissä verrattuna kontrolleihin (Fig. 2). Mielenkiintoista on, että potilailla, joilla oli samanaikaisesti sekä HSV-1-että CMV-infektio, oli korkeimmat TNF-α-ja IL-6-pitoisuudet. Lisäksi kahdella kolmesta potilaasta (potilaat 2 ja 8), joilla ei ollut merkkejä virusinfektiosta, TNF-α-pitoisuus oli alhaisempi. Tätä negatiivista korrelaatiota ei todettu IL-6-pitoisuuksilla näillä potilailla.

Keskustelu

Tämä tutkimus viittaa käsitykseen, että herpesvirusinfektio saattaa edistää välilevyn rappeutumista. Löysimme HSV-1: n ja CMV: n DNA: ta suuresta määrästä ihmisen nikamavälilevynäytteitä, jotka otettiin discektomian aikana.

aiemman matala-asteisen infektion on esitetty olevan mahdollinen syy välilevyn rappeutumiseen. 2,4 useat kirjoittajat ovat korostaneet Modisten tyypin 1 signaalien (T2-painotetuissa MR-kuvissa lisääntynyt luuytimen signaalin voimakkuus ja T1-painotetuissa MR-kuvissa vähentynyt signaalin voimakkuus ja päätelevyissä oleva fibrovaskulaarinen kudos) ja infektion välistä suhdetta. 13, 14 Jos potilaalla ei ole vaikeaa selkäkipua, kuumetta tai epänormaalia veriprofiilia, Modic 1-muutoksia ja matala-asteista infektiota on vaikea erottaa toisistaan. 13, 14

virusinfektion ja apoptoosin välistä yhteyttä on tutkittu laajasti, mikä selventää virusten aiheuttaman apoptoosin induktion mekanismeja. 15,16 nyt tiedetään, että Parvovirus B19 ja erityisesti sen NS-1-proteiini vaikuttavat voimakkaasti sytotoksisesti isäntäsoluihin ja aiheuttavat apoptoosia infektoituneissa soluissa. 17 viruksilla on rooli niveltulehduksen eri muotojen patogeneesissä. Stahl et al 5 havaitsi virus-DNA: ta useista viruksista synoviaalikudoksessa, joka otettiin potilailla, joilla oli varhainen niveltulehdus. Tuoreen tutkimuksen mukaan nivelrikon pitkälle edenneet vaiheet voivat olla yhteydessä Parvovirus B19: n aiheuttamaan lisääntyneeseen tulehdukseen ja nivelruston vaurioitumiseen. 18 toisessa tutkimuksessa ehdotettiin, että ihmisen Parvovirus B19 on mukana käynnistämistä ja jatkamista synovitis nivelreumassa, johtaa nivelvaurioita aikana liiallinen synteesi tulehdussytokiinien ja proteolyyttisiä entsyymejä.

HSV-1-tartunnat ovat endeemisiä kaikkialla maailmassa. Yli 90 prosentilla aikuisista on HSV-1: n vasta-aineita viidenteen vuosikymmeneen mennessä. Herpesvirukset ovat kaikkialla esiintyviä taudinaiheuttajia lapsilla, jotka jäävät piileviksi aktiivisen infektion jälkeen. 20, 21 infektion alkuvaiheen aikana viruksen replikaatio tapahtuu gangliassa, ja jotkin solut, jotka ylläpitävät viruksen perimää yhteensopivana normaalin solutoiminnan kanssa, säilyvät elossa. Tämä isäntäsolujen ja viruksen välinen hieno tasapaino voi häiriintyä erilaisten ärsykkeiden vaikutuksesta, mikä johtaa uudelleenaktivoitumiseen. 22

tutkimuksessamme yhdelläkään potilaista ei ollut ollut akuuttia herpesinfektiota. Tämä näkyi sekä serologisella tasolla, koska ääreisverestä ei löytynyt IgM+ – vasta-aineita, että molekyylitasolla, koska levynäytteistä ei saatu viruksen mRNA-transkriptejä. Näin ollen HSV-1-infektion suuri esiintyvyys lapsuudessa ja sen säilyttäminen hermostossa saattavat tarjota tyydyttävän selityksen sekä HSV-1: n että CMV: n esiintymiselle nikamavälilevyssä.

herää kysymys, miten virukset pääsevät nikamavälilevytilaan. On hyvin todettu, että suuret verisuonikanavat kulkevat päätylevyjen poikki varhaislapsuuden aikana, jotka myöhemmin pienenevät syntymän myötä ja häviävät kokonaan 4-6 vuoden iässä, mikä tekee levystä yhden suurimmista avaskulaarisista kudostyypeistä kehossa. 23 voisi spekuloida, että virus-DNA: n esiintyminen nikamavälilevyssä on toissijaista makrofagien tai muiden viruksen DNA: ta sisältävien solujen siirtymiseen kiekkoon lapsuudessa, kun levyympäristössä on vielä runsaasti verisuonia. Myös muilla mekanismeilla voi olla merkitystä, sillä on tunnettua, että herpes simplex-virus voi aktivoitua neuronaalisissa aksoneissa tulehduksellisten sytokiinien, kuten IL-1: n ja TNF-α 24,25: n avulla, ja antidromaalinen migraatio saattaa liittyä välilevytilaan.

näin tulehtunut tai vahingoittunut välilevy, joka tuottaa erilaisia proinflammatorisia sytokiineja, aktivoi piileviä viruksia. Nämä mekanismit voivat myös selittää kahden tai useamman viruksen DNA: n esiintymisen levynäytteissä. Vaikka virusten esiintyminen olisi toissijainen ilmiö, niiden esiintyminen voi edistää välilevyn rappeuman patogeneesiä, sillä virusantigeenit tehostavat välilevyn rappeutumista entisestään aktivoimalla tulehdusmiljöötä, mikä helpottaa aktivoituneita makrofageja ja muita soluja aiheuttamaan kudosvaurioita.

tutkimuksessamme leikkausalan intra-operatiivinen arviointi paljasti makroskooppisia todisteita herniated-välilevyä ympäröivästä tulehduksesta. Näyttö välilevynäytteiden tulehduksesta ja virusinfektion osuudesta tulehdusprosessin tehostumiseen saatiin analysoimalla tulehdukseen liittyvien tunnettujen geenien, kuten TNF-α: n ja IL-6: n mRNA-pitoisuuksia. Molempien tulehdusmerkkiaineiden pitoisuudet potilaiden näytteissä olivat noin kaksi-kolme kertaa suuremmat kuin verrokeilla. On mielenkiintoista, että näytteissä, joissa oli samanaikaisesti sekä HSV-1 että CMV-tartunta, oli korkeimmat TNF-α-ja IL-6-pitoisuudet, mikä viittaa virusten synergistiseen vaikutukseen. Lisäksi TNF-α-pitoisuudet olivat yhtä alhaiset kuin verrokkitapaukset potilailla, joissa viruksen DNA: ta ei voitu havaita.

tuoreessa katsausartikkelissa todetaan, että välilevyn rappeuma ei ole diagnoosi vaan ilmentymä välilevyn tilasta, joka on seurausta useiden tekijöiden vaikutuksesta, yksittäin tai kollektiivisesti. 1 sen sijaan, että se olisi seurausta yhden prosessin, levy rappeutuminen voi olla useita mahdollisia syitä, kuten mekaaninen, ikääntyminen, geneettinen, systeeminen, myrkyllinen ja/tai infektio. Viruksen toteamisen puuttuminen kaikilla 16 potilaallamme on sopusoinnussa levyn esiinluiskahduksen monitekijäisen syy-yhteyden kanssa. Tiedetään, että perintötekijät tuottavat matriisiin 26-28 poikkeavia komponentteja, jotka vaarantavat levyn rakenteen ja toiminnan ja lisäävät levyn kudoksen alttiutta mekaaniselle rasitukselle. 29 epidemiologista tutkimusta on osoittanut, että geneettiset tekijät lisäävät rappeutumisriskiä, 30-35, mutta ne eivät selitä kaikkia tapauksia, 28,36 ja vaihtelua eri etnisten väestöryhmien välillä 37 niin, että tarvitaan laajoja monietnisiä väestötutkimuksia. 38

virusten esiintyminen levyssä saattaa luoda asetelman, jossa levy on altis mekaanisen rasituksen ja trauman aiheuttamille vaurioille. On todennäköistä, että virus-DNA olisi läsnä nikamavälilevyjen tasoilla, mutta mekaaninen korostaa, että on oletettu edistää rappeuma tapahtuu lumbosacral tasolla, jossa ongelmat ovat paljon yleisempiä. 1 matala-asteinen infektio, geneettisellä vaikutuksella tai ilman, saattaa lisätä nikamavälilevyn alttiutta ympäristötekijöille, jotka toissijaisesti ajavat levyn rappeutumiseen johtavia biologisia tapahtumia. Mahdollisesti herpes-DNA toimii tekijänä, joka muuttaa levyn matriisin rakenteellisia ominaisuuksia moduloimalla apoptoosia ja paikallista tulehdusreaktiota, mikä viittaa siihen, että tautiin liittyy virusinfektio tai uudelleenaktivoituminen.

Marshallin ja Warren 39: n löytö siitä, että Helicobacter pylorin aiheuttama infektio oli syynä mahahaavan kehittymiseen, johti merkittävään muutokseen lääketieteellisessä ymmärryksessä. Mahdollisuutta, että tarttuva prosessi voi edistää välilevyn rappeutumista, on harkittava vakavasti.

uskomme, että tämä on ensimmäinen tutkimus, joka dokumentoi herpesvirusten esiintymisen välilevytyrä-potilaiden nikamavälilevyssä. Lisätutkimukset ovat tarpeen, jotta voidaan määrittää taustalla olevat mekanismit ja tukea herpesvirusten mahdollista roolia rappeuttavan välilevysairauden patogeneesissä.

missään muodossa ei ole saatu eikä saada etuja kaupalliselta taholta, joka on suoraan tai välillisesti sidoksissa tämän artikkelin aiheeseen.