kineettinen analyysi LINE WEAVER-BURK yhtälö kaksinkertainen vastavuoroinen käyrä entsyymin kinetiikka

8.3. Lineweaver –Burk-yhtälö (kaksinkertainen vastavuoroinen juoni) :

vuonna 1934 Lineweaver ja Burk tekivät yksinkertaisen matemaattisen muutoksen Michalies-Menten-yhtälöön piirtämällä substraatin konsentraation ja reaktionopeuden kaksinkertaisen käänteisarvon.

Line weaver Burk–juoni saadaan ottamalla michalies-Menteris-yhtälön (MME) molemmilta puolilta käänteisarvo.

Weaver Burkin (LB) viivalla Michaelis Menten-yhtälö muunnetaan suoraksi viivakäyräksi.

sitä käytetään Vmax-arvon estimointiin leikkauspaikasta X-akselilla.

• suora saadaan kaavalla Y = MX + C, jossa C on Y: n regression leikkauspiste X: llä ja M on kaltevuus.
• jos M-arvo nousee, niin kaltevuus kasvaa.
• jos Vmax: n arvo on vakio, niin Km: n arvo on suuri ja jos Km: n arvo on vakio, Vmax: n arvo pienenee.

tässä hyperbolinen käyrä muuttuu suoraksi ja janan X-leikkauspisteen itseisarvo on entsyymin affiniteetti (1 / Km) substraatille. Y-leikkaus on 1 / Vmax. Radan kaltevuus on Km / Vmax. Jälleen, alun perin tämä tehtiin subjektiivisesti. Se on paljon hienompi tapa löytää parhaiten sopivat parametrit kääntämätön Michaelis-Menten suhde.

Application

Lineweaver–Burk-kuviota käytetään Km: n ja Vmax: n määrittämiseen. Tällaisen kuvaajan Y-leikkaus vastaa Vmax: n käänteislukua; kuvaajan X-leikkaus on -1/Km. Se antaa nopean, visuaalisen vaikutelman entsyymieston eri muodoista.

8.4. Eadie–Hofstee–käyrä

Eadie-Hofstee-Diagrammi on entsyymikinetiikan graafinen esitys, jossa reaktionopeus piirretään nopeuden ja substraattikonsentraation suhteen funktiona:

tässä Michaelis Menten-yhtälö esitetään

invertoi ja kerrotaan Vmax: lla :

Eadie–Hofstee-tontin soveltaminen

km: n ja Vmax: n nopea tunnistaminen

8.5. Hanes Woolf-käyrä

graafinen esitys substraatin alkukonsentraation ja reaktionopeuden V suhteesta piirretään substraattikonsentraatiota vastaan .

Michaelis-Menten-yhtälö johdetaan seuraavasti:

invertoi ja kerrotaan :

Rearrange :

This equation will give straight line of slope a Y-intercept of and an X-intercept of –km

Application :-

Used for determination of Km, Vmax and Vmax/Km parameters

8.6. Entsyymin inhibitio

entsyymit ovat proteiineja, jotka toimivat katalyyttinä reaktioissa. Mutta siellä toimintaa estävät tai estävät molekyylit, jotka ovat kemiallisia aineita (orgaanisia / epäorgaanisia) luonnossa. Näitä molekyylejä tai yhdisteitä kutsutaan inhibiittoreiksi ja prosessia, jolla ne inaktivoivat entsyymin tai estävät sen toiminnan, kutsutaan entsyymin inhibitioksi.

ne estävät entsyymin katalyyttistä aktiivisuutta reversiibelisti tai peruuttamattomasti muuttamalla entsymaattiseen aktiivisuuteen tarvittavia aminohappojen sivuketjuja.

lääkeaineanalogit ovat suunniteltu monien antitoksiinien vieroitukseen, koska niillä on estävä vaikutus.

8.6.1. Säännöt, joita seuraa entsyymin inhibitioreaktiot

1. entsyymi sitoutuu substraattiin suhteessa 1 : 1 aktiivisessa kohdassa lukkojärjestyksessä tai indusoidussa fit: ssä.
2. Inhibiittoriyhdisteet kilpailevat substraatin kanssa allosteerisesta katalyyttisestä kohdasta first come first-periaatteella tehden entsyymin inhibiittorisubstraateista komplekseja tai entsyymin inhibiittorikomplekseja.
3. entsyymi ja substraatti tai inhibiittorit reagoivat keskenään kineettisesti, mikä ilmaistaan katalyyttisen reaktion kineettisinä vakioina.
4. fysiologiset olosuhteet, kuten pH, lämpötila, substraatin tai reaktanttien pitoisuus, määräävät entsymaattisten reaktioiden nopeuden.
5. Entsyymialayksiköiden, substraatin tai inhibiittorin aktiivisten ryhmien väliset molekyylien väliset muodot, sitoutumisominaisuudet: elektrofiilinen, hydrofiilinen, nukleofiilinen ja metalloprotien luonne; vetysidos vaikuttaa entsyymin kokonaisreaktionopeuksiin ja inhibitiotapaan.

8.6.2. Inreversible entsyymi inhibition tyypit

8.6.2.1. Kompetitiivinen inhibitio (reversiibeli) : tässä esiintyy kilpailua inhibiittorin ja aktiivisen kohdan substraatin välillä.

entsyymin katalyyttinen kohta on inhibiittorin miehittämä ja sen aktiivisuus on estynyt. Mutta esto on palautuva. Tällöin muodostuu sekä entsyymin substraattia että entsyymin inhibiittorikompleksia.

vaikutus affiniteettiin :- kun inhibiittoripitoisuus kasvaa, sen affiniteetti kasvaa, mutta substraatin affiniteetti vähenee ja Km-arvo kasvaa. Mutta kun substraattipitoisuus kasvaa, niin sen affiniteetti kasvaa ja inhibiittorin affiniteetti vähenee ja Km-arvo laskee, ts.,

inhibiittori sitoutuu entsyymin aktiivisiin kohtiin, jolloin inhibiittori kilpailee substraatin kanssa sitoutumisesta aktiiviseen kohtaan, jolloin substraatin affiniteetti entsyymiin vähenee ja Km-arvo kasvaa. Uuden km: n antaa Km, jossa

missä

I = inhibiittorin pitoisuus

KDI = inhibiittorin dissosiaatiovakio.

inhibiittoripitoisuuden kasvaessa km-arvo kasvaa substraatin affiniteetin vähentyessä. Jos dissosiaatiovakio on enemmän, entsyymin inhibiittorikompleksi enemmän, A on vähemmän siten km on vähemmän. A: n arvo on yhtä suuri kuin 1 tai suurempi kuin 1. Km: n uusi arvo on aKm

vaikutus Vmaxiin

Vmax lasketaan äärettömällä substraattipitoisuudella.

Vmax = kcat

äärettömässä substraattipitoisuudessa kaikki entsyymit ovat entsyymisubstraattikompleksina i.e. Vmax is not affected.

Lineweaver Burk plot of competitive inhibition

8.6.2.2. Examples of Competitive Inhibitors

(a) Allopurinol :

Drug used for treatment of gout. Uric acid is formed in the body by oxidation of hypoxanthine by the enzyme xanthine oxidase. Allopurinol is structurally similar to hypoxanthine and inhibits the enzyme xanthine oxidase and reduced uric acid formation.

(b) metotreksaatti:

se on dihydrofolaattireduktaasin (DHFR) kompetitiivinen inhibiittori. Tätä lääkettä käytetään syövän hoitoon. Se on rakenteellisesti samanlainen kuin foolihappo, joten se estää folaattireduktaasia kilpailevasti. Se estää tetrahydrofolaatin muodostumista. Siksi DNA-synteesi kärsii.

(C) MAO-estäjät (monoamiinioksidaasi):

ne ovat ensimmäisen luokan masennuslääkkeitä, joita kehitetään. MAO-estäjät lisäävät serotoniinin dopamiinipitoisuutta estämällä MAO: ta. esim. Katekoliamiinit (epinefriini ja norepinefriinit).

(d) dikumaroli:

tämä lääke on samanlainen kuin K-vitamiini.Lääkevarfariini toimii antikoagulanttina estämällä kilpailevasti K-vitamiinia

8.6.3. Kilpailukyvytön inhibitio

inhibiittorin ja substraatin välillä ei ole kilpailua, koska substraatin ja inhibiittorin sitoutumiskohdat ovat erilaiset. Estäjällä ei ole rakenteellista samankaltaisuutta substraatin kanssa, joten cant sitoutuu vapaaseen entsyymiin. Estäjät sitoutuvat entsyymisubstraattikompleksiin, joka paljastaa estäjien sitoutumiskohdan. Inhibiittorin sitoutuminen voi aiheuttaa katalyysin inaktivoivan aktiivisen kohdan tai allosteerisen kohdan vääristymistä.

vaikutus affiniteettiin:

inhibiittorin suuri affiniteetti tarkoittaa entsyymin substraattikompleksin vähäistä dissosioitumista entsyymisubstraattiin. Tässä inhibiittori sitoutuu toiseen silloin aktiiviseen kohtaan entsyymisubstraattikompleksiin. Se tarkoittaa, että inhibiittori osoittaa affiniteettia es-kompleksille pikemminkin kuin entsyymille. Näin inhibiittorin läsnä ollessa entsyymin affiniteetti substraattiin kasvaa. Tämä vähentää Km. Siksi

vaikutus Vmaxiin

Vmax lasketaan äärettömällä substraattipitoisuudella. Äärettömässä substraattipitoisuudessa kaikki entsyymit ovat entsyymien substraattikompleksina. Inhibiittorilla on affiniteettia entsyymien substraattikompleksiin. Näin inhibiittori sitoutuu entsyymien substraattikompleksiin ja estää entsyymin substraattikompleksin katalyysin entsyymiksi ja tuotteeksi. That’s why Vmax decreases and new Vmax is given by

Inhibitor concentration increases a value increases and Vmax decreases

On putting the values of new Km and new Vmax in lineweaver burk plot, The equation is as follows :-

Uncompetitive inhibitor causes different intercepts on both Y and X-axis but same slope.

8.6.4. Sekoitettu (ei-kompetitiivinen) inhibitio

tämä inhibiittori ei ole rakenteellisesti samanlainen kuin substraatti, mutta se voi sitoutua vapaaseen entsyymiin ja entsyymi-substaattikompleksiin molempiin.

kun inhibiittori sitoutuu entsyymiin pois aktiivisista paikoista. Se indusoi konformaatiomuutoksia ja vähentää katalyyttistä aktiivisuuttaan. Näin entsyymin inhibiittori ja entsyymin substraatin inhibiittorikompleksit tulevat tuottamattomiksi. Substraattikonsentraatio ei kumoa reaktiota. Esto johtaa siis muuttumattomaan Km: hen, mutta pienentyneeseen Vmax: iin.

lineweaver Burk-käyrää käytetään Km: n ja Vmax: n määrittämiseen entsyymikinetiikassa. Y-siepata tällaisen kuvaajan vastaa käänteistä Vmax, X siepata kuvaajan edustaa kilpailevia estäjiä siten samat Y-sieppauksia (kuten Vmax ei vaikuta kilpailevia estäjiä), mutta on olemassa erilaisia slops.

non competitive inhibitor tuottaa tontin, jossa on sama X-intercepti kuin Km ei vaikuta, mutta eri rinteet Y-interceptillä.

8.7. Monisubstraattireaktion kinetiikka

entsyymin kinetiikassa yksinkertaisissa reaktioissa yksi substraatti sitoutuu entsyymiin ja käy läpi katalyyttisiä reaktioita. Tämä ehto ei ole yleinen. Suurinta osaa biokemiallisista reaktioista katalysoivat kaksi tai useampi reaktioihin osallistuva substraatti. Esimerkiksi entsyymi E katalysoi reaktiota, jossa oli mukana kaksi substraattia A ja B, ja tuottaa tuotteen P ja Q.

tämän tyyppistä reaktiota kutsutaan Bi-Substraattireaktioksi . Nämä reaktiot voivat edetä kahdella tavalla:

8.7.1. Juokseva

Sekä substraattien A ja B, sitoutuvat entsyymin E, ja sitten reaktioita etenee tuotto tuotteita, P ja Q,

Tämän tyyppinen reaktio on nimeltään peräkkäisiä tai yksinkertainen-siirtymä reaktioita, jotka ovat edelleen jaettu seuraaviin ryhmiin.

Ordered substrate binding or order sequential mechanism – tässä tyypissä yhden substraatin on sitouduttava ennen toista substraattia.

tämä reaktio kertoo substraattien peräkkäisestä sitoutumisesta sekä tuotteen vaiheittaisesta vapautumisesta. Tämän tyyppinen mekanismi on havaittavissa laktaattidehydrogeenien katalysoimissa reaktioissa, joissa on mukana nad+ ja laktaatti.

8.7.2. Satunnainen substraattisidos-tässä tyypissä joko A tai B voi sitoutua ensin entsyymiin, sitten toiseen substraattiin ja tuotteen vapautumiseen.

This type of mechanism is observed in reactions catalyzed by transferases enzyme as hexokinase catalyzed phosphorylation of glucose by ATP.

8.7.3. Theorell-Chance Sequential mechanism

It is a type of ordered sequential bisubstrate reaction in which the ternary complex does not accumulate.

8.7.4. Ping pong-mekanismi

toinen mahdollisuus bi-substraattireaktiossa on, että yksi substraatti, A, sitoutuu entsyymiin ja sen kanssa reagoidessaan vapautuu tuote, P, ja entsyymi muuttuu muunnettuun muotoon, E’. Toinen substraatti, B, tulee sisään ja sitoutuu modifioidulla entsyymillä tuottamaan toisen tuotteen, Q ja uudistamaan entsyymin, E.

yllä olevaa mekanismia seuraavia reaktioita kutsutaan Ping-Pong-tai kaksoissiirtymäreaktioiksi. Tällaista mekanismia havaitaan aminotransferaasien katalysoimissa reaktioissa.

nämä entsyymit katalysoivat aminoryhmän siirtymistä aminohaposta α-ketohapoksi.Muodostuvia tuotteita ovat uusi aminohappo, joka vastaa ketohappoa ja uusi ketohappo, joka vastaa aminohapon hiilirunkoa, kuten:-

toinen esimerkki ping pong-reaktiosta on fosfoglyseraattimutaasi. Entsyymi saa fosfaattia yhdeltä substraatilta ja entsyymin fosforylaation jälkeen fosfaatti siirretään toiselle substraatille.

NextPrevious