4.7 Protein Folding ja siihen liittyvät sairaudet

proteiineja syntetisoidaan ribosomeilla orastavina polypeptideinä endoplasmaisen retikulumin (er) lumenissa. Sekundaariset ja tertiääriset rakenteet määrittävän proteiinien aminohappojärjestyksen sanelee mRNA: n nukleotidijärjestys. MRNA-sekvenssit puolestaan määritetään DNA-sekvenssien avulla (luvut 23-25232425). Kuten edellä mainittiin, Paulingin ja Anfinsenin klassiset kokeet johtivat käsityksiin, että tietyt keskeiset aminohapot oikeissa asennoissa ovat välttämättömiä proteiinien taittamiseksi kolmiulotteiseksi, funktionaaliseksi, ainutlaatuiseksi konformaatioksi. On hämmästyttävää, että sadoista miljoonista konformaatiomahdollisuuksista vain yksi konformaatiomuoto liittyy funktionaaliseen proteiiniin. Väli-polypeptidien taittumisen ohjaamista ja kohdentamista täysin taitettuihin rakenteisiin auttavat joissakin tapauksissa molekyylikassiireiksi (chaperonins) kutsutut proteiinit (Kuva 4-13).

kuva 4-13. Proteiinin taittumisreitti. Normaali taittuminen tapahtuu valvojien ja muiden tekijöiden avulla. Polypeptidien väärinkäyttö voi johtaa kohdistamiseen sopimattomiin solukohtiin tai laadunvalvontaprosessin osana tapahtuvaan hajoamiseen tai aggregaatioon. Aggregaatti on usein resistentti proteolyysille ja muodostaa aggregaatteja, kuten amyloidiplakkeja.

Esiliinat sitoutuvat reversiibelisti avautuviin polypeptidisegmentteihin ja estävät niiden sekoittumisen ja ennenaikaisen aggregaation. Tähän prosessiin liittyy ATP: n hydrolyysin tuottama energiameno. Chaper-Onien pääluokka ovat lämpöshokkiproteiinit (hsp), joita syntetisoidaan sekä prokaryoottisissa että eukaryoottisissa soluissa vastauksena lämpöshokkiin tai muihin jännityksiin (esim.vapaiden radikaalien altistuminen). Solun eri organelleissa esiintyy monia lämpöshokkikapinaluokkia (HSP-60, HSP-70 ja HSP-90). HSP-70-Esiliinat sisältävät kaksi domeenia: ATPaasi-domeenin ja peptidejä sitovan domeenin. Ne stabiloivat orastavia polypeptidejä ja pystyvät myös muuntamaan polypeptidien denaturoituja muotoja. Chaperonien HSP-70-perheessä on runsaasti sekvenssihomologiaa eri lajien kesken (esim.E. coli ja ihmisen HSP-70-proteiinit osoittavat 50% sekvenssihomologiaa).

toinen kaitsija, kalnexin, on 90 kDa: n Ca2+-sitova proteiini ja ER: n integraali kalvofosfoproteiini. Kalnexin valvoo vasta syntetisoitujen glykoproteiinien vientiä kompleksoimalla glykosylaation läpikäyneillä väärin solutetuilla glykoproteiineilla (16.luku). Jos valkuaista ei voida taittaa oikeaan konformaatioonsa, Esiliinat auttavat tuhoutumisessa. Taittumista helpottavat myös ioniympäristö, kofaktorit ja entsyymit. Taittumiseen vaikuttavat esimerkiksi proteiinidisulfidi-isomeraasi, joka katalysoi oikeiden disulfidisidosten muodostumista, ja peptidyyliprolyyli-isomeraasit, jotka katalysoivat spesifisten aminohappo-proliini-peptidisidosten cis-trans-isomeroitumista.

kuva 4-14. Alzheimerin tautia sairastavan potilaan aivokuoren osa, joka sisältää neurofibrillaarista vyyhtiä (A) ja neuriittistä plakkia (B). Sektio käsiteltiin Bielsehowskyn tahralla. (John M. Hardmanin luvalla.)

solunulkoisten plakkien pääainesosa on amyloidi β-proteiini (Aß), joka aggregoituu 8 nm: n filamenteiksi. Aß on 40 tai 42 aminohapon jäämien peptidi ja se on proteolyyttisesti johdettu transmembraanisesta glykoproteiinista, joka tunnetaan β-amyloidin prekursoriproteiinina (β APP). ßAPP: n aß: ksi pilkkovia entsyymejä kutsutaan sekretaaseiksi. ßAPP on laajalti ilmaistu erityisesti aivoissa, ja sen geeni on paikallistettu kromosomiin 21Q. kaksi merkittävää havaintoa ovat auttaneet ymmärtämään aß-peptidien roolia Alzheimerin taudin patologiassa. Ensimmäinen on se, että Downin oireyhtymää sairastavilla potilailla on trisomia 21 (ts., kolme kromosomi 21: n sijaan kaksi), näytteille Aß talletukset, ja kehittää klassisia piirteitä Alzheimerin taudin iässä 40 vuotta tai aikaisemmin. Toiseksi autosomaalisesti dominoivassa Alzheimerin taudissa on havaittu useita ßAPP: n missense-mutaatioita. Nämä ßAPP: n dominoivat mutaatiot vaikuttavat haitallisesti sekretaasien toimintaan joko lisäämällä absoluuttista aß-erittymisnopeutta (N-terminaaliset mutaatiot) tai lisäämällä suhdetta Aß42-Aß40 (C-terminaaliset mutaatiot).

perinnöllisiä Alzheimerin taudin häiriöitä on alle 1% kaikista tapauksista. Aß-peptidit kerääntyvät β-rakenteiksi, jotka johtavat fibrilleihin. Aß42-peptidit ovat neurotoksisempia ja tuottavat myrkyllisiä vaikutuksia monilla toisiinsa liittyvillä mekanismeilla. Näihin voi liittyä oksidatiivinen vamma, muutokset solunsisäisessä Ca2+ homeostaasissa, sytoskeletaalinen uudelleenjärjestely ja sytokiinien toiminta.

intraneuronaaliset tanglet ovat pitkien parillisten kierteisten rihmastojen kimppuja, jotka koostuvat mikrotubulukseen liittyvästä proteiinista tau. Tau-proteiinin normaali tehtävä on vakauttaa hermosolujen mikrotubuluksia tehostamalla tubuliinin polymeroitumista. Normaalisti tau-proteiini liukenee; liian fosforyloituneena se kuitenkin muuttuu liukenemattomaksi filamenttipolymeeriksi. Fosforylaatio – /defosforylaatiotapahtumien säätelyhäiriöiden on katsottu johtuvan tiettyjen kinaasien tehostuneesta aktiivisuudesta ja tiettyjen fosfataasien heikentyneestä aktiivisuudesta. Siinä missä plakit ovat patognomonisia AD: lle, vyyhtejä löytyy etiologisesti erilaisista neurologisista sairauksista. Poikkeavan hyperfosforylaation häiriöitä ja tau-proteiinin poikkeavaa aggregaatiota fibrillaaripolymeereihin kutsutaan taupatioiksi. Esimerkkejä taupatioista AD: n lisäksi ovat progressiivinen supranukleaarinen halvaus, Pickin tauti, kortikobasaalinen degeneraatio ja frontotemporaalinen dementia.

kaksi muuta geeniä ßAPP: n lisäksi on yhdistetty Alzheimerin taudin autosomaalisesti hallitsevien muotojen varhaiseen puhkeamiseen. Kaksi muuta aiheuttavaa geeniä sijaitsevat kromosomeissa 14 ja 1 ja koodaavat transmembraaniproteiinispreseniliini 1 (koostuu 467 aminohapon jäämistä) ja preseniliini 2 (koostuu 448 aminohapon jäämistä). Näitä proteiineja syntetisoidaan neuroneissa, mutta niiden toimintaa ei tunneta. Preseniliinigeenien mutaatiot johtavat kuitenkin aß42-peptidien liialliseen tuotantoon.

Alzheimerin taudin satunnaiset muodot, jotka aiheuttavat 90% kaikista tapauksista, ovat monimutkaisia sairauksia ja voivat edustaa sekä ympäristötekijöiden että geneettisten ominaisuuksien yhteisvaikutusta, joka ilmenee pitkän ajan kuluessa. Kromosomissa 19 olevan apolipoproteiini E: n (apo E) polymorfisen geenin eri muotoja on havaittu esiintyvän useammin Alzheimerin tautia sairastavilla henkilöillä. Apo E-geenissä on kolme alleelia, joissa on kuusi yhdistelmää: ε2 / ε2, ε3/ε3, ε4/ε4, ε2/ε3, ε2/ε4 ja ε3 / ε4. Apo E on lipidikantajaproteiini, joka syntetisoidaan pääasiassa maksassa, mutta sitä syntetisoidaan myös astrosyyteissä ja neuroneissa. Apo E-proteiinien toimintaa lipoproteiinien aineenvaihdunnassa ja niiden suhdetta ennenaikaiseen ateroskleroosiin käsitellään luvussa 20.

Apo E: n useista genotyypeistä kahden Apo e ε4-alleelin hankkiminen voi jopa kahdeksankertaistaa Alzheimerin taudin riskin. Jokainen Apo E-geenin kopio lisää riskiä ja siirtää alkamisajan alempaan ikään. Biokemiallinen mekanismi, jolla apo e ε4-proteiini osallistuu vyyhtien ja plakkien muodostumiseen, on epäselvä. On ehdotettu useita mekanismeja, nimittäin vuorovaikutusta tau-proteiinin ja sukupolven kanssa sekä aß-peptidien poistumista.

Alzheimerin taudin lääkehoito koostuu kolinergisen vajeen korjaamisesta antamalla asetyylikoliiniesteraasin estäjiä (esim.takriini, donepetsiili). Alzheimerin tautia sairastavien naisten estrogeenihoito on yhdistetty parantuneeseen kognitiiviseen suorituskykyyn. Estrogeenin suotuisa vaikutus voi johtua kolinergisistä ja neurotrofisista vaikutuksista. Muut terapeuttiset strategiat on suunnattu estämään tai vähentämään neurotoksisten peptidien muodostumista. Lisäksi lääkkeet, jotka valikoivasti sulattavat aggregoituja peptidejä, voivat osoittautua hyödyllisiksi. Kokeellinen rokote, joka sisältää plakkia tuottaville hiirille annettua AP-peptidiä, johtaa siihen, että nuoremmilla hiirillä plakkien muodostuminen vähenee ja vanhemmilla hiirillä plakkien häviäminen vähenee. Muutokset plakin muodostuksessa hiirillä liittyivät muistin ja oppimiskyvyn säilymiseen. Rokotus ei aiheuttanut koe-eläimillä autoimmuunivastetta eikä toksista reaktiota. Nämä tutkimukset ovat siis antaneet sysäyksen ihmisrokotteen kehittämiselle.

arvioitaessa Alzheimerin tautia sairastavaa potilasta on oleellista, että dementian muut hoidettavissa olevat syyt suljetaan pois määrittämällä kriittiset biokemialliset ja kliiniset parametrit. Jotkut hoidettavissa, suhteellisen yleisiä poikkeavuuksia, jotka tuottavat dementia ovat huumeiden väärinkäyttö, elektrolyyttitasapainon, kilpirauhasen poikkeavuudet, ja B12-vitamiinin puutos; harvinaisempia poikkeavuuksia ovat kasvain, aivohalvaus ja Wernicken enkefalopatia.

Transtyretiini-amyloidoosi (kutsutaan myös familiaaliseksi amyloidipolyneuropatiaksi) on autosomaalinen dominoiva oireyhtymä, jolle on ominaista perifeerinen neuropatia. Tämä tauti johtuu yhdestä viidestä mutaatiosta, jotka on tähän mennessä tunnistettu transtyretiinin geenissä. Transtyretiiniä kutsutaan myös prealbumiiniksi (vaikka sillä ei ole rakenteellista suhdetta albumiiniin), koska se vaeltaa albumiinin edellä standardielektroforeesissa pH 8,6: ssa. Transtyretiini syntetisoidaan maksassa ja se on normaali plasman proteiini, jonka pitoisuus on 20-40 mg/dL. Se kuljettaa tyroksiinia ja retinolia sitovaa proteiinia (luku 38). Transtyretiinin pitoisuus laskee merkittävästi aliravitsemuksessa ja plasmapitoisuudet ovat diagnostisia aliravitsemuksen häiriöitä (Luku 17).

transtyretiinin geeni sijaitsee kromosomissa 18 ja se ilmaistaan konstitutiivisesti. Transtyretiinin primaarirakenne koostuu 127 aminohappojäännöksestä ja kahdeksasta β-levyrakenteesta, jotka on järjestetty vastakkaiseen konformaatioon yhdensuuntaisille tasoille (Kuva 4-15).

kuva 4-15. Transtyretiinin rakenne. Molekyylissä on kahdeksan vastakkaista β-juostetta (A-H), jotka ovat järjestyneet kahteen yhdensuuntaiseen tasoon. Kiertävä muoto transtyretiini on tetrameeri. Jotkut mutaatiot transtyretiini geeni liittyy amyloidoosi ja kahdeksan aminohappo muutoksia aiheuttaa tämän taudin on osoitettu. Plasmassa transtyretiini on tetrameeri, joka koostuu identtisistä monomeereista. Näyttää siltä, että mutaatiot saavat transtyretiinin monomeerisen avautumattoman välituotteen kasaantumaan liukenemattomaksi β-amyloidifibriilimuodostumaksi.

Tse: llä voi esiintyä periytyvää, tarttuvaa ja satunnaisia esityksiä. Lisäksi perinnöllinen sairaus voi olla myös tarttuva. CJD esiintyy sekä periytyvänä autosomaalisesti dominoivana häiriönä että tarttuvassa muodossa. ”Vain proteiini” – hypoteesissa poikkeava prioniproteiini, joko ulkoisista lähteistä tuotu tai mutatoituneen prioniproteiinigeenin tuottama, vaikuttaa normaaliin proteiinin taittumiseen ja siirtää prioniproteiinin taittumista kohti epänormaalin prioniproteiinin muodostumista. Normaalin prioniproteiinin, jonka funktiota ei tunneta, muuttuminen poikkeavaan muotoon sisältää konformaatiomuutoksen kovalenttisen modifikaation sijaan. Poikkeava prioniproteiini toimii siemenenä, joka indusoi normaalin solun prioniproteiinin kohti epänormaaleja amyloidogeenisiä rikkaita β-rakenneproteiineja, joita voidaan lisätä ja siirtää muihin soluihin. Amyloidia muodostavan prioniproteiinin aggregoitunut muoto on resistentti proteolyysille.

luonnossa esiintyvä proteaasille herkkä prioniproteiini muuttuu proteaasiresistanssiseen muotoon in vitro sekoittamalla nämä kaksi proteiinia. Nämä proteaasiresistentit prioniproteiinit eivät kuitenkaan tartu. Näin ollen prionitartunnan” proteiini-only ” – hypoteesissa poikkeavan konformaation hankkiminen ei riitä infektiivisyyden leviämiseen. Kuitenkin, hiiva (Saccharomyces cerevisiae) järjestelmä, epänormaali prionimuoto hiivaproteiinin, käyttöön liposomi fuusio, pystyy siemen itse lisääntyvä konformaatio muutos normaalien proteiinien, jotka kerääntyvät aggregaatteja. Aggregaatit tarttuvat tytärhiivasoluihin epänormaalin fenotyypin lisääntymisen ohella.

viime aikoina on ilmennyt vakava kansanterveysongelma, kun on osoitettu, että nautojen prionitauti voi ylittää lajirajat ja tarttua ihmisiin. Tämä tapahtui, kun naudoille syötettiin scrapie-tartunnan saaneista lampaista tehtyä jauhoa. Naudat sairastuivat BSE: hen (jota kutsutaan yleisesti ”hullun lehmän taudiksi”). Kun ihmiset myöhemmin söivät prionin saastuttamaa naudanlihaa, pieni joukko, pääasiassa Isossa-Britanniassa, kehitti CJD: n muunnoksen (vCJD) noin viisi vuotta myöhemmin. CJD: n varianttimuoto on ainutlaatuinen prionitaudin muoto, joka esiintyy paljon nuoremmalla väestöllä kuin olisi odotettavissa periytyvästä tai sporadisesta CJD: stä. Sekä BSE: llä että vCJD: llä on monia samankaltaisia patologisia ominaisuuksia, jotka viittaavat etiologiseen yhteyteen ihmisen vCJD: n ja nautojen BSE: n välillä.

tuumorisuppressoriproteiini p53 tarjoaa vielä yhden esimerkin proteiinin sekoittumisesta, joka voi johtaa patologisiin vaikutuksiin, tässä tapauksessa syöpiin (p on proteiinille ja 53 sen likimääräiselle molekyylipainolle 53 000). P53: n geeni sijaitsee kromosomissa 17 (17 p) olevassa lyhyessä haarassa ja koodaa 393-aminohappoista fosfoproteiinia. Monissa syövissä p53-geeni on mutatoitunut ja normaalin p53-proteiinin puute on yhdistetty jopa 40 prosentin ihmisen syöpien kehittymiseen.

normaali p53 toimii tuumorisuppressorina ja on transkriptiotekijä, joka normaalisti osallistuu useiden geenien säätelyyn, joita tarvitaan solujen kasvun säätelyyn, DNA: n korjautumiseen ja optoosiin (ohjelmoitu solukuolema). Normaali p53 on tetrameeri ja se sitoutuu DNA: han sekvenssispesifisesti. Yksi p53: n säätelemistä geeneistä tuottaa P21-nimistä proteiinia, joka häiritsee solusykliä sitoutumalla sykliinikinaaseihin. Muita p53: n säätelemiä geenejä ovat MDM2 ja BAX. Entinen geeni koodaa proteiinia, joka estää p53: n toimintaa toimimalla osana säätelevää palautemekanismia. Bax-geenin tuottamalla proteiinilla arvellaan olevan rooli p53: n aiheuttamassa apoptoosissa.

useimmat p53-geenien mutaatiot ovat somaattisia missense-mutaatioita, joissa on aminohapposubstituutioita DNA: ta sitovassa domeenissa. P53: n mutanttimuodot ovat väärin sidottuja proteiineja, joilla on poikkeavia konformaatioita ja kyvyttömyys sitoutua DNA: han, tai ne ovat vähemmän stabiileja. Yksilöt, joilla on harvinainen häiriö Li-Fraumenin oireyhtymä, (autosomaalinen hallitseva piirre) on yksi mutatoitunut p53-geeni ja yksi normaali p53-geeni. Nämä henkilöt ovat lisänneet alttiutta moniin syöpiin, kuten leukemiaan, rintojen karsinoomat, pehmytkudossarkoomat, aivokasvaimet, ja osteosarkoomat.

käynnissä on kliinisiä tutkimuksia, joissa selvitetään, onko normaalin p53-geenin kulkeutumisella kasvainsoluihin geeniterapian avulla (Luku 23) suotuisia vaikutuksia syövän hoidossa. Varhaiset tulokset p53 geeniterapia osoittavat, että se voi kutistua kasvain laukaisemalla apoptoosi.