ANALISI CINETICA LINEA WEAVER-BURK EQUAZIONE DOPPIA TRAMA RECIPROCA DELLA CINETICA ENZIMATICA

8.3. Lineweaver-Burk equation (Double reciprocal plot) :

Nel 1934, Lineweaver e Burk apportarono una semplice modifica matematica all’equazione di Michalies –Menten tracciando un doppio inverso della concentrazione del substrato e della velocità di reazione.

La trama di Burk del tessitore di linea si ottiene prendendo il reciproco di entrambi i lati dell’equazione di michalies–Menteris (MME).

Nella trama del tessitore di linee Burk (LB) l’equazione di Michaelis Menten viene convertita in curva retta.

Viene utilizzato per stimare il Vmax dalla posizione di intercetta sull’asse X.

• La linea retta è data da Y = MX + C, dove C è Y intercetta della regressione di Y su X e M è pendenza.
• Se il valore M aumenta, la pendenza aumenta.
• Se rendiamo il valore di Vmax uguale a costante, il valore Km è alto e se il valore Km è costante, il valore Vmax diminuisce.

In questo la curva iperbolica diventa una linea retta e il valore assoluto di X-intercetta della linea è l’affinità (1/Km) dell’enzima per il substrato. L’intercetta Y è 1 / Vmax. La pendenza della linea è Km / Vmax. Ancora una volta, in origine questo è stato fatto soggettivamente. È il metodo molto più fine per trovare i parametri più adatti per la relazione Michaelis-Menten non trasformata.

Applicazione

La trama Lineweaver–Burk usa per determinare il Km e Vmax,. L’intercetta Y di tale grafico è equivalente all’inverso di Vmax; l’intercetta X del grafico rappresenta -1/Km. Dà un’impressione rapida e visiva delle diverse forme di inibizione enzimatica.

8.4. Eadie–Hofstee Trama

Eadie–Hofstee diagramma è una rappresentazione grafica della cinetica enzimatica in cui la velocità di reazione è rappresentata in funzione del rapporto tra il tasso e la concentrazione di substrato:

In questo Michaelis Menten equazione è rappresentata come

Inverti e si moltiplica con Vmax :

Applicazione di Eadie–Hofstee Plot

Identificazione rapida di Km e Vmax

8.5. Trama di Hanes Woolf

La rappresentazione grafica del rapporto tra la concentrazione iniziale del substrato e la velocità di reazione V viene tracciata rispetto alla concentrazione del substrato .

L’equazione di Michaelis-Menten è derivata come

Inverti e moltiplica per :

Rearrange :

This equation will give straight line of slope a Y-intercept of and an X-intercept of –km

Application :-

Used for determination of Km, Vmax and Vmax/Km parameters

8.6. Inibizione enzimatica

Gli enzimi sono proteine che agiscono come catalizzatore per le reazioni. Ma lì l’attività è inibita o bloccata dalle molecole che sono sostanze chimiche (organiche / inorganiche) in natura. Queste molecole o composti sono chiamati inibitori e il processo mediante il quale inattivano l’enzima o bloccano la sua attività è chiamato inibizione enzimatica.

Inibiscono l’attività catalitica enzimatica in modo reversibile o irreversibile modificando le catene laterali degli amminoacidi necessarie per l’attività enzimatica.

Nella scoperta dei farmaci, gli analoghi dei farmaci sono progettati per la disintossicazione di molte antitossine in quanto hanno un’azione inibitoria.

8.6.1. Regole seguite da reazioni di inibizione enzimatica

1. L’enzima si lega con il substrato in rapporto 1 : 1 nel sito attivo in una disposizione a chiave o in un adattamento indotto.
2. I composti inibitori competono con il substrato per il sito catalitico allosterico in base al primo arrivato per rendere complesso il substrato dell’inibitore enzimatico o complessi di inibitori enzimatici.
3. Enzima e substrato o inibitori reagiscono tra loro in modo cinetico espresso come costanti cinetiche di una reazione catalitica.
4. Condizioni fisiologiche come pH, temperatura, concentrazione di substrato o reagenti determinano la velocità delle reazioni enzimatiche.
5. Forme intermolecolari tra subunità enzimatiche, interazioni di gruppo attivo substrato o inibitore, proprietà fisiche di natura legante: natura elettrofila, idrofila, nucleofila e metalloprotienica; legame idrogeno influenzano i tassi di reazione enzimatica complessiva e modalità di inibizione.

8.6.2. Tipi di inibizione enzimatica non reversibile

8.6.2.1. Inibizione competitiva (reversibile): In questo, competizione presente tra inibitore e substrato per il sito attivo.

Il sito catalitico dell’enzima è occupato da inibitore e la sua attività è inibita. Ma l’inibizione è reversibile. In questo caso, si formano sia il substrato enzimatico che il complesso inibitore enzimatico.

Effetto sull’affinità: – Quando la concentrazione dell’inibitore aumenta la sua affinità aumenta ma l’affinità del substrato diminuisce e il valore Km aumenta. Ma quando la concentrazione del substrato aumenta allora il suo aumento di affinità e l’affinità di inibitore diminuisce e il valore di Km diminuisce, cioè.,

L’inibitore si lega ai siti attivi di enzimi che significa che l’inibitore compete con il substrato per il legame al sito attivo, quindi l’affinità del substrato verso enzima diminuisce, di conseguenza, Km aumenti di valore. La nuova km è dato da Km, dove

dove

I = concentrazione di inibitore

Kdi = costante di dissociazione dell’inibitore.

Quando la concentrazione dell’inibitore aumenta, il valore km aumenta al diminuire dell’affinità del substrato. Se la costante di dissociazione di è più, complesso inibitore enzimatico più, a è meno quindi km è meno. Il valore di a è uguale a 1 o maggiore di 1. Il nuovo valore di Km è aKm

Effetto su Vmax

Vmax viene calcolato a concentrazione di substrato infinita.

Vmax = Kcat

A concentrazione di substrato infinita tutti gli enzimi sono sotto forma di complesso di substrato enzimatico i.e. Vmax is not affected.

Lineweaver Burk plot of competitive inhibition

8.6.2.2. Examples of Competitive Inhibitors

(a) Allopurinol :

Drug used for treatment of gout. Uric acid is formed in the body by oxidation of hypoxanthine by the enzyme xanthine oxidase. Allopurinol is structurally similar to hypoxanthine and inhibits the enzyme xanthine oxidase and reduced uric acid formation.

(b) Metotrexato:

È un inibitore competitivo della diidrofolato reduttasi (DHFR). Questo farmaco è usato per la terapia del cancro. È strutturalmente simile all’acido folico Quindi, inibisce la folato reduttasi in modo competitivo. Previene la formazione di tetra hydrofolate. Quindi, la sintesi del DNA è sofferta.

(c) Inibitori delle MAO (Mono ammina ossidasi):

Sono la prima classe di antidepressivi da sviluppare. Gli inibitori delle MAO aumentano il livello di serotonina dopamina inibendo le MAO. ad es. Catecolamine (epinefrina e noradrenalina).

(d) Dicumarol:

Questo farmaco è simile alla vitamina K. Il farmaco warfarin agisce come anticoagulante inibendo competitivamente la vitamina K.

8.6.3. Inibizione non competitiva

Non c’è competizione tra inibitore e substrato poiché i siti di attaccamenti del substrato e dell’inibitore sono diversi. L’inibitore non ha somiglianza strutturale al substrato quindi non può legarsi all’enzima libero. Gli inibitori si legano con il complesso del substrato enzimatico che espone il sito di legame dell’inibitore. Il legame dell’inibitore può causare la distorsione del sito attivo o del sito allosterico che inattiva la catalisi.

Effetto sull’affinità:

Alta affinità dell’inibitore significa bassa dissociazione del complesso del substrato enzimatico rispetto al substrato enzimatico. In questo, l’inibitore lega ad altro sito allora attivo sul complesso del substrato dell’enzima. Ciò significa che l’inibitore mostra affinità per il complesso ES piuttosto che per l’enzima. Così alla presenza di inibitore l’affinità di enzima verso il substrato aumenta. Questo diminuire il Km. Pertanto

Effetto su Vmax

Vmax viene calcolato a concentrazione di substrato infinita. A concentrazione di substrato infinita tutti gli enzimi sono sotto forma di enzimi substrato complesso. L’affinità di manifestazione dell’inibitore per il complesso del substrato degli enzimi. Così l’inibitore lega al complesso del substrato degli enzimi ed impedisce la catalisi del complesso del substrato degli enzimi nell’enzima e nel prodotto. That’s why Vmax decreases and new Vmax is given by

Inhibitor concentration increases a value increases and Vmax decreases

On putting the values of new Km and new Vmax in lineweaver burk plot, The equation is as follows :-

Uncompetitive inhibitor causes different intercepts on both Y and X-axis but same slope.

8.6.4. Inibizione mista (non competitiva)

Questo inibitore non è simile al substrato strutturalmente ma può legarsi all’enzima libero e al complesso enzimatico substate entrambi.

Quando l’inibitore si lega all’enzima lontano dai siti attivi. Induce i cambiamenti conformazionali e riduce la sua attività catalitica. Pertanto, i complessi inibitore enzimatico e inibitore del substrato enzimatico diventano non produttivi. La concentrazione del substrato non inverte la reazione. Quindi, l’inibizione conduce a Km inalterato ma Vmax ridotto.

Lineweaver Burk plot viene utilizzato per determinare Km e Vmax nella cinetica enzimatica. L’intercetta Y di tale grafico è equivalente all’inverso di Vmax, l’intercetta X del grafico rappresenta gli inibitori competitivi quindi gli stessi Y-intercetta (come Vmax non è influenzato dagli inibitori competitivi) ma ci sono diversi slops.

Inibitore non competitivo produce trama con la stessa X-intercetta come Km è inalterato, ma diverse pendenze con Y-intercetta.

8.7. Cinetica della reazione multisubstrato

Nella cinetica enzimatica, le reazioni semplici coinvolgono un substrato che si lega a un enzima e subisce reazioni catalitiche. Questa condizione non è comune. La maggior parte delle reazioni biochimiche catalizzate da due o più substrati che prendono parte alle reazioni. Ad esempio, un enzima E, catalizzato la reazione che coinvolge due substrati A e B e produrre il prodotto P e Q.

Questo tipo di reazione è chiamato come reazione Bi-substrato . Queste reazioni possono procedere in due modi:

8.7.1. Sequenziale

Entrambi i substrati A e B, si legano all’enzima E, e poi le reazioni proventi per produrre i prodotti P e Q

Questo tipo di reazione è chiamata sequenziale o a semplice reazioni di spostamento, che sono ulteriormente suddivise nelle seguenti categorie.

Legame ordinato del substrato o meccanismo sequenziale ordinato – In questo tipo, un substrato deve legare prima di un secondo substrato.

Questa reazione indica il legame sequenziale dei substrati e il rilascio sequenziale del prodotto. Questo tipo di meccanismo è osservato nelle reazioni catalizzate dai deidrogeni del lattato che coinvolgono NAD+ e lattato.

8.7.2. Legame casuale del substrato – In questo tipo A o B possono legarsi prima all’enzima, seguito dall’altro substrato e dal rilascio del prodotto.

This type of mechanism is observed in reactions catalyzed by transferases enzyme as hexokinase catalyzed phosphorylation of glucose by ATP.

8.7.3. Theorell-Chance Sequential mechanism

It is a type of ordered sequential bisubstrate reaction in which the ternary complex does not accumulate.

8.7.4. Meccanismo ping pong

L’altra possibilità nella reazione bi-substrato è che un substrato, A, si lega all’enzima e reagendo con esso un prodotto, P, viene rilasciato e l’enzima si trasforma in una forma modificata, E’. Il secondo substrato, B, arriva e si lega con modificato enzima di rendimento secondo prodotto, Q e rigenerare l’enzima, E.

Le reazioni dopo il meccanismo sopra indicato, sono chiamati a Ping-Pong o fare doppio reazioni di spostamento. Questo tipo di meccanismo è osservato nelle reazioni catalizzate dalle aminotransferasi.

Questi enzimi catalizzano il trasferimento di un gruppo amminico da un amminoacido ad un α-cheto acido.I prodotti formati sono un nuovo amminoacido corrispondente all’acido cheto e un nuovo acido cheto corrispondente allo scheletro di carbonio dell’amminoacido come:-

Un altro esempio di reazione da ping pong è la fosfoglicerato mutasi. L’enzima ottiene il fosfato da un substrato e dopo la fosforilazione dell’enzima, il fosfato viene trasferito al secondo substrato.

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