La degenerazione del disco è una condizione comune con un’eziologia multifattoriale complessa. 1 L’infezione di basso grado è stata proposta come causa della degenerazione del disco con l’acne di Propionibacterium identificata nell ‘ 84% dei pazienti con ernia del disco e sciatica utilizzando sierologia e colture. 2 Sono stati osservati anche cambiamenti molecolari come l’aumento della produzione di enzimi catabolici (catepsina, lisozima e diverse metalloproteinasi a matrice) e citochine infiammatorie. 3 Pazienti giovani con ernia del disco lombare hanno mostrato un recupero più povero dopo l’intervento chirurgico quando avevano mostrato concentrazioni sieriche elevate di proteina C-reattiva ad alta sensibilità (hs-CRP) pre-operativamente. Tuttavia, non è chiaro se alti livelli di CRP e citochine infiammatorie indicano un’infezione locale o una risposta infiammatoria all’ernia del disco. 4

Agenti patogeni come il virus Parvo B19 o il virus Epstein Barr (EBV) svolgono un ruolo importante nella patogenesi di varie forme di artrite. I virus dell’herpes 5,6 sono una famiglia diversificata di grandi virus a DNA, ognuno dei quali può stabilire infezioni latenti per tutta la vita. L’infezione primaria con molti di questi virus è comune durante l’infanzia. 7,8

Questo studio mirava a indagare il potenziale ruolo dei virus dell’herpes, del virus dell’herpes Simplex di tipo 1(HSV-1), del virus dell’herpes Simplex di tipo 2 (HSV-2) e del citomegalovirus (CMV), nella patogenesi della degenerazione del disco intervertebrale. Un’analisi molecolare di campioni di dischi intervertebrali ottenuti durante la discectomia ha mostrato una notevole frequenza di DNA CMV e HSV-1 nei dischi degenerati, suggerendo che le infezioni virali potrebbero essere un fattore importante nell’eziologia di questa malattia.

Pazienti e metodi

Sono stati studiati un totale di 16 pazienti consecutivi sottoposti a discectomia entro sei mesi dall’ernia del disco lombare. C’erano otto uomini e otto donne con un’età media di 40,38 anni (da 17 a 65). Lo studio ha avuto l’approvazione etica. La diagnosi di ernia del disco lombare è stata stabilita mediante esame fisico e risonanza magnetica. Al fine di fornire un gruppo di controllo, sono stati ottenuti campioni di dischi per via percutanea da due pazienti con fratture a scoppio toracolombare sottoposti a intervento chirurgico. Questi pazienti sono stati sottoposti anche all’esame MRI pre-operatorio per escludere la degenerazione concomitante. La natura dei campioni testati in questo studio non ha permesso l’inclusione di più dischi intervertebrali da individui sani per ragioni etiche, mentre l’alternativa di campioni cadaverici come controlli, è stata abbandonata in quanto la maggior parte della popolazione adulta ha una storia di lombalgia e degenerazione del disco.

Oltre al materiale dell’ernia del disco ottenuto durante la discectomia, è stato prelevato un campione di sangue periferico da ciascun paziente. I campioni di tessuto sono stati posti in polipropilene sterilizzato 1.provette da 5 ml e conservate a -80 ° C, fino all’estrazione di DNA/RNA e alla reazione a catena della polimerasi/ reazione a catena quantitativa della polimerasi (PCR/qRT-PCR). La rilevazione di anticorpi HSV-1 e CMV, IgM+ e IgG+ dal plasma è stata effettuata utilizzando un saggio immunoenzimatico standard.

Estrazione di DNA / RNA.

Il DNA genomico e l’RNA totale sono stati estratti dai campioni di tessuto utilizzando il kit NucleoSpin Tissue XS e il kit NucleoSpin RNA XS (Macherey-Nagel GmbH and Co., Düren, Germania), rispettivamente, secondo le istruzioni del produttore. L’RNA purificato è stato ulteriormente trattato con DNaseI per evitare qualsiasi contaminazione del DNA. Le concentrazioni dei campioni di DNA e RNA sono state determinate utilizzando uno spettrofotometro (260 nm) prima dell’amplificazione della PCR o della qRT-PCR.

Rilevamento del DNA dei virus dell’herpes.

Abbiamo testato otto diversi virus herpes (HSV-1/-2, Varicella Zoster Virus (VZV), EBV, CMV, Herpes Virus umani 6, 7 e 8 (HHV6, HHV7 e HHV8)) utilizzando RhyMA Test-Herpes Screening secondo le istruzioni del produttore (Euroclone, Pavia, Italia). Il test RhyMA si basava sulla tecnologia di ibridazione inversa che prevedeva l’amplificazione del DNA multiplex mediante PCR con primer specifici biotinilati, seguita dall’ibridazione dei frammenti di DNA amplificati e biotinilati con strisce su sonde, specifiche per ciascuno dei virus dell’herpes. Per la valutazione dei risultati è stata necessaria una reazione finale di sviluppo utilizzando un sistema biotina-streptavidina. Controlli positivi e di amplificazione sono stati inclusi anche in ogni striscia. Per l’interpretazione dei risultati, la striscia sviluppata di ciascun campione è stata allineata con una tabella standard. Lo screening RhyMA Test-Herpes è concesso in licenza per uso diagnostico in vitro, certificando l’elevata specificità e sensibilità del test. Al fine di verificare i risultati ottenuti utilizzando il test di screening RhyMA-Herpes, i prodotti PCR sono stati eseguiti anche in un gel di agarosio a basso punto di fusione al 3% che produce il modello elettroforetico previsto per ciascun virus. Infine, i campioni PCR-positivi sono stati sottoposti ad analisi di sequenziamento diretto, confermando i risultati ottenuti utilizzando il test RhyMA-Herpes screening assay.

HSV-1 e CMV qRT-PCR.

L’RNA totale è stato trascritto in senso inverso utilizzando il kit RETRO-script (Ambion Inc., Austin, Texas, Stati Uniti d’America) con primer hexamer casuali. I CDNA sono stati testati per la qualità del modello costruendo curve standard utilizzando diluizioni seriali di ciascun cDNA come modelli in QRT-PCR. I modelli cDNA fornivano un’efficienza di analisi dal 90% al 105% e la R2 di tutte le curve standard era > 0,98. In seguito alla trascrizione inversa, i CDNA sono stati amplificati utilizzando primer specifici per ICP0 e IE1 per la quantificazione rispettivamente degli MRNA HSV-1 e HCMV, come descritto in precedenza. 9,10

Tutte le QRT-PCR sono state eseguite in triplice copia utilizzando Maxima SYBR Green qPCR master mix (Fermentas Inc., Glen Burnie, Maryland) in un ABI PRISM 7500 Sequence Detector (PE Biosystems, Foster City, Canada), compresi i campioni di RNA estratti così come i controlli positivi e negativi. La fluorescenza verde SYBR è stata misurata nel corso di 40 cicli di amplificazione. Per ogni modello quantificato, è stato calcolato il numero medio del ciclo in cui l’accumulo del prodotto è entrato nell’intervallo lineare (CT). I valori CT replicati erano entro 0,4 cicli l’uno dall’altro. Il valore CT 18SrRNA per un dato modello è stato sottratto dal CT ottenuto per ogni mRNA di interesse (ICP0 e IE1) dallo stesso modello per ottenere il valore CT normalizzato (ΔCT) per ciascun modello.

Espressione genica del fattore di necrosi tumorale-α e dell’interleuchina-6.

Per la quantificazione dell’mRNA TNF-α o IL-6, è stato utilizzato 1 µl di cDNA insieme ai primer mostrati sopra in una reazione di 20 µl, utilizzando SYBR green come marker per il contenuto di DNA. I primer utilizzati erano: beta actina: Forward: 5′-TCAGAAGAACTC CTA TGT GG-3′, Reverse: 5 ‘- TCT CTT TGA TGT CAC GCA CG-3′; TNF-a Forward: 5′-CAC GCT CTT CTG TCT ACT GAA CTT CG-3′, Reverse: 5′-GGC TGG GTA GAG AAT GGA TGA ACA CC-3′, 11 IL-6: Forward: 5′-ACA GCC ACT CAC CTC TTC AG -3′, Reverse: 5′ – GTG CCT CTT TGC TGC TTT CAC -3’. 12 Nessun sottoprodotto era presente nella reazione come indicato dal modello di dissociazione fornito alla fine della reazione e dall’elettroforesi su gel di agarosio (dati non mostrati). L’efficienza di amplificazione dei prodotti TNF-α e IL-6 era la stessa di quella della beta actina come indicato dalle curve standard di amplificazione, permettendoci di utilizzare la formula: aumento di piega = 2-(ΔCt A-ΔCtB). Le reazioni sono state eseguite in triplice copia per consentire una valutazione statistica.

Risultati

Un test di ibridazione PCR–reverse è stato impiegato per esaminare il DNA di otto diversi virus dell’herpes nei campioni di dischi intervertebrali di pazienti con ernia del disco (Fig. 1). Il DNA dell’herpesvirus è stato rilevato in 13 campioni su 16 (81,25%). HSV-1 ha presentato la più alta prevalenza in nove pazienti (56,25%), mentre la CMV è stata rilevata in sei pazienti (37,5%) (Tabella I). Due pazienti sono stati co-infettati sia con HSV-1 che con CMV. Il DNA di HSV-2, VZV, EBV, HHV6, HHV7 e HHV8 non è stato rilevato nei campioni di disco di nessuno dei pazienti. Nessuno dei pazienti di controllo (C1 e C2) è risultato positivo alla presenza del DNA del virus dell’herpes (Fig. 1).

Lo stato dell’infezione da HSV-1 e CMV, nei campioni del disco intervertebrale, è stato esaminato studiando la potenziale espressione dei trascritti virali mediante qRT-PCR in tempo reale. L’espressione genica del virus dell’herpes non è stata rilevata in nessuno dei campioni testati, dimostrando l’assenza di un’infezione virale attiva, suggerendo così la creazione di infezione da herpesvirus latente in questi campioni.

È stata esaminata anche la sieropositività dei pazienti. Tutti i pazienti HSV-1 o CMV PCR-positivi presentavano anticorpi IgG+ per lo stesso virus, rispettivamente (Tabella I). In tre casi per HSV-1 e in sei casi per CMV, sono stati rilevati anticorpi IgG+ senza prevalenza simultanea di DNA virale. Inoltre, gli anticorpi HSV-1 e CMV IgM + del sangue periferico erano negativi in tutti i pazienti, indicando che nessuno dei pazienti aveva manifestato un’infezione acuta da virus dell’herpes al momento dell’escissione chirurgica.

Oltre all’indicazione macroscopica dell’infiammazione che circonda l’ernia del disco, abbiamo anche ottenuto prove sperimentali di infiammazione nei campioni del disco intervertebrale esaminando i livelli di mRNA di TNF-α e IL-6, in tutti i campioni utilizzando qRT-PCR. L’analisi ha mostrato un aumento approssimativamente da due a tre volte di entrambi i marcatori infiammatori nei campioni rispetto ai controlli (Fig. 2). È interessante notare che i pazienti che sono stati co-infettati sia da HSV-1 che da CMV hanno mostrato i livelli più alti di TNF-α e IL-6. Inoltre, due pazienti su tre (pazienti 2 e 8) senza evidenza di infezione virale hanno mostrato livelli più bassi di TNF-α. Questa correlazione negativa non è stata trovata per i livelli di IL-6 in questi pazienti.

Discussione

Il presente studio suggerisce il concetto che l’infezione da virus dell’herpes potrebbe promuovere la degenerazione del disco. Siamo stati in grado di rilevare il DNA HSV-1 e CMV in un gran numero di campioni di dischi intervertebrali umani raccolti durante la discectomia.

L’infezione precedente di basso grado è stata suggerita come possibile causa di degenerazione del disco. 2,4 Diversi autori hanno sottolineato la relazione tra segnali modici di tipo 1 (aumento dell’intensità del segnale midollare nelle immagini MR ponderate in T2 e diminuzione dell’intensità del segnale nelle immagini MR ponderate in T1 e nel tessuto fibrovascolare nelle piastre terminali) e infezione. 13,14 Se i pazienti non hanno un forte mal di schiena, febbre o un profilo ematico anomalo, è difficile distinguere tra Modic 1 e infezione di basso grado. 13,14

La relazione tra infezione virale e apoptosi è stata ampiamente studiata, chiarendo i meccanismi di induzione dell’apoptosi da parte dei virus. 15,16 Ora è noto che il Parvovirus B19 e in particolare la sua proteina NS-1, ha un potente effetto citotossico sulle cellule ospiti e causa l’apoptosi nelle cellule infette. 17 Virus svolgono un ruolo nella patogenesi di varie forme di artrite. Stahl et al 5 ha rilevato DNA virale da più virus nel tessuto sinoviale prelevato da pazienti con artrite precoce. Uno studio recente ha suggerito che gli stadi avanzati dell’osteoartrite possono essere correlati ad un aumento dell’infiammazione e del danno alla cartilagine articolare a causa del Parvovirus B19. 18 In un altro studio, è stato proposto che il Parvovirus umano B19 è coinvolto nell’iniziazione e nella perpetuazione della sinovite nell’artrite reumatoide, portando a lesioni articolari nel corso di un’eccessiva sintesi di citochine infiammatorie ed enzimi proteolitici. 19

Le infezioni da HSV-1 sono endemiche in tutto il mondo. Oltre il 90% degli adulti ha anticorpi contro HSV-1 entro la quinta decade. I virus dell’herpes sono patogeni onnipresenti nei bambini, rimanendo latenti dopo un’infezione attiva. 20,21 Durante la fase iniziale dell’infezione, la replicazione virale si verifica nei gangli con la sopravvivenza di alcune cellule che mantengono il genoma virale compatibile con la normale funzione cellulare. Questo sottile equilibrio tra le cellule ospiti e il virus può essere disturbato da vari stimoli, portando alla riattivazione. Nel nostro studio, nessuno dei pazienti aveva manifestato un’infezione acuta da herpes. Ciò era evidente sia a livello sierologico, a causa dell’assenza di anticorpi IgM+ dal sangue periferico, sia a livello molecolare a causa della mancanza di trascritti virali di mRNA dai campioni del disco. Pertanto, l’alta prevalenza dell’infezione da HSV-1 nell’infanzia, così come la sua ritenzione nel sistema nervoso, potrebbero offrire una spiegazione soddisfacente della presenza sia di HSV-1 che di CMV nel disco intervertebrale.

Sorge la domanda su come i virus entrano nello spazio del disco intervertebrale. È ben noto che grandi canali vascolari attraversano le placche terminali durante la vita fetale precoce, che successivamente diminuiscono con la nascita e scompaiono completamente all’età di quattro-sei anni, rendendo il disco uno dei più grandi tipi di tessuto avascolare nel corpo. 23 Si potrebbe ipotizzare che la presenza di DNA virale nel disco intervertebrale sia secondaria alla migrazione di macrofagi o altre cellule che contengono DNA virale nel disco durante l’infanzia mentre l’ambiente del disco è ancora ricco di vasi sanguigni. Altri meccanismi potrebbero anche svolgere un ruolo in quanto è ben noto che il virus dell’herpes simplex può essere attivato negli assoni neuronali da citochine infiammatorie, come IL-1 e TNF-α 24,25 e attraverso la migrazione antidromatica potrebbe coinvolgere lo spazio del disco.

Così, il disco infiammato o ferito, che produce una varietà di citochine pro-infiammatorie, attiva i virus latenti. Questi meccanismi potrebbero anche spiegare la presenza di DNA da due o più virus nei campioni del disco. Anche se la presenza di virus è un fenomeno secondario, la loro presenza può contribuire alla patogenesi della degenerazione del disco intervertebrale poiché gli antigeni virali migliorano ulteriormente il deterioramento del disco attivando l’ambiente infiammatorio che facilita i macrofagi attivati e altre cellule a causare danni ai tessuti.

Nel nostro studio, la valutazione intraoperatoria del campo chirurgico ha rivelato evidenza macroscopica di infiammazione che circonda l’ernia del disco. L’evidenza dell’infiammazione nei campioni del disco e il contributo dell’infezione virale al miglioramento del processo infiammatorio provenivano dall’analisi dei livelli di mRNA di geni ben noti, che sono associati all’infiammazione, come il TNF-α e IL-6. Entrambi i marcatori infiammatori hanno dimostrato livelli approssimativamente da due a tre volte superiori nei campioni dei pazienti rispetto ai controlli. È interessante notare che i campioni che sono stati co-infettati da HSV-1 e CMV hanno mostrato i più alti livelli di TNF-α e IL-6, suggerendo un effetto sinergico dei virus. Inoltre, i livelli di TNF-α erano bassi come i casi di controllo tra i pazienti in cui non potevamo rilevare il DNA virale.

Un recente articolo di revisione afferma che la degenerazione del disco non è una diagnosi ma un’espressione dello stato del disco, che è il risultato di diversi fattori che agiscono, individualmente o collettivamente. 1 Piuttosto che essere il risultato di un singolo processo, la degenerazione del disco può avere una serie di possibili cause tra cui meccanica, invecchiamento, genetica, sistemica, tossica e/o infezione. L’assenza di rilevazione virale in tutti i nostri 16 pazienti è in accordo con la causalità multifattoriale del prolasso del disco. È noto che i fattori genetici producono componenti anormali della matrice 26-28 che compromettono la struttura e la funzione del disco e aumentano la suscettibilità del tessuto discale alle sollecitazioni meccaniche. 29 Studi epidemiologici hanno dimostrato che i fattori genetici aumentano il rischio di degenerazione, 30-35 ma non tengono conto di tutti i casi, 28,36 con variazioni tra diverse popolazioni etniche 37 tali che sono necessari grandi studi sulla popolazione multietnica. 38

La presenza dei virus nel disco potrebbe creare un’impostazione in cui il disco è vulnerabile a danni causati da stress meccanici e traumi. È probabile che il DNA virale sia presente ai livelli dei dischi intervertebrali, ma le sollecitazioni meccaniche che sono postulate per contribuire alla degenerazione avvengono a livello lombosacrale dove i problemi sono molto più comuni. 1 L’infezione di basso grado, con o senza influenza genetica, potrebbe aumentare la suscettibilità del disco intervertebrale a fattori ambientali, che guidano secondariamente gli eventi biologici con conseguente degenerazione del disco. Forse il DNA dell’herpes agisce come un fattore che altera le caratteristiche strutturali della matrice nel disco modulando l’apoptosi e la risposta infiammatoria locale, suggerendo che l’infezione virale o la riattivazione è associata alla malattia.

La scoperta di Marshall e Warren 39 che l’infezione da Helicobacter pylori era responsabile dello sviluppo di ulcere gastriche ha portato a un importante cambiamento nella comprensione medica. La possibilità che un processo infettivo possa contribuire alla degenerazione del disco dovrebbe essere considerata seriamente.

Crediamo che questo sia il primo studio che documenta la presenza di virus dell’herpes nel disco intervertebrale di pazienti con ernia del disco. Ulteriori studi sono necessari per determinare i meccanismi sottostanti e sostenere il potenziale ruolo dei virus dell’herpes nella patogenesi della malattia degenerativa del disco.

Tabella I. Caratteristiche cliniche dei pazienti con ernia del disco lombare e la prevalenza del Virus Herpes Simplex tipo 1 (HSV-1) e il Citomegalovirus (CMV) nel disco intervertebrale campioni

Paziente	Età	Genere	HSV-1	CMV
1	50	F	+	+
2	25	F	−	−
3	23	F	+	−
4	17	M	+	−
5	28	M	−	+
6	42	F	+	−
7	37	F	+	−
8	52	M	−	−
9	44	M	+	−
10	33	F	+	−
11	40	M	+	−
12	42	M	−	+
13	51	F	+	+
14	44	M	−	+
15	53	F	−	+
16	65	M	−	−

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