TESTO

I virus sperimentano ambienti molto diversi a seconda che si replichino all’interno di una cellula ospite o in transito da un host all’altro. All’interno di una cellula, il virus e i componenti del virus sono esposti a un ambiente riducente, in cui il potenziale redox è determinato principalmente dal glutatione (18). Al contrario, al di fuori di una cellula, il virus è esposto all’ossigeno e ai prodotti tossici derivati dall’ossigeno, come il perossido di idrogeno, il superossido e il radicale idrossilico, specie reattive che hanno il potenziale per inattivare il virus. Per far fronte a tali composti altamente reattivi, piante e animali esprimono enzimi in grado di convertirli in prodotti non tossici. Esempi di tali enzimi sono catalasi, perossidasi e superossido dismutasi (28). Qui, descriviamo i risultati di studi che dimostrano la presenza di catalasi all’interno del virione herpes simplex purificato. Sono stati quindi effettuati test per determinare se la catalasi interna potesse proteggere il virus dall’inattivazione da parte di H2O2.

Studi di catalasi sono stati effettuati con herpes simplex virus 1 (HSV-1) che è stato coltivato su cellule Vero in coltura e purificato mediante centrifugazione gradiente di densità di saccarosio. Quando le sospensioni del virus sono state regolate all ‘ 1% di H2O2, le bolle di ossigeno hanno iniziato a formarsi prontamente, indicando la presenza di catalasi(Fig. 1a, tubo sinistro). Le bolle sono apparse visivamente dopo alcuni secondi di incubazione a temperatura ambiente e hanno continuato a formarsi e ingrandirsi per almeno 20 min. Non si formano bolle, tuttavia, se l’inibitore della catalasi sodio azide è stato aggiunto alla sospensione del virus prima del trattamento con H2O2 (Fig. 1a, a destra). I test sono risultati negativi anche quando (i) il virus è stato rimosso dalla soluzione mediante centrifugazione prima dell’aggiunta di H2O2 o (ii) HSV-1 capsids (B capsids) sono stati sostituiti per virus intatto. In saggi simili, bolle che indicano la presenza di catalasi non sono state osservate con virus della stomatite vescicolare purificato o adenovirus umano 2 (dati non mostrati). L’analisi Western blot ha confermato la presenza di catalasi associata al virus HSV – 1 ma non all’adenovirus, al virus della stomatite vescicolare (VSV) o ai capsidi HSV-1 A (Fig. 1 ter).

Identificazione della catalasi associata a HSV-1 mediante saggio enzimatico (a), analisi Western blot (b) e centrifugazione del gradiente di densità del saccarosio (c). Il pannello a mostra un tubo contenente HSV-1 purificato 20 min dopo che la soluzione è stata regolata all ‘ 1% di H2O2 (tubo sinistro) e un’incubazione simile a cui è stato aggiunto un inibitore della catalasi (2 mm di sodio azide) prima di H2O2 (a destra). Notare la formazione di bolle nel tubo sinistro, indicando la presenza di catalasi nel virus. La concentrazione del virus era di 0,25 mg/ml in TNE (0,01 M Tris-HCl, 0,5 M NaCl, 1 mm EDTA, pH 7,5) e l’incubazione era a temperatura ambiente. Il virus era il ceppo KOS di HSV-1, che è stato coltivato su colture monostrato di cellule Vero e purificato mediante centrifugazione a gradiente di densità di saccarosio, e il titolo è stato determinato mediante diluizione endpoint come descritto in precedenza (14). Il pannello b mostra i risultati di un test Western blot per la presenza di catalasi in HSV-1, adenovirus umano 2 (HAd2), virus della stomatite vescicolare (VSV) e capsidi HSV-1 A. Adenovirus umano 2 e virus della stomatite vescicolare (Indiana; Ceppo San Juan) sono stati coltivati su colture monostrato di cellule HeLa e Vero, rispettivamente, e purificati da procedure precedentemente descritte (12, 17). I metodi pubblicati sono stati utilizzati anche per la purificazione dei capsidi HSV-1 A e B (23). Le principali proteine del capside sono state rilevate colorando la macchia con l ‘ 1% di Ponceau S (fila superiore), mentre la catalasi è stata rilevata immunotaining con anticorpo specifico per catalasi (Calbiochem; coniglio policlonale 219010; diluizione 1:5.000) (15). Si noti che la catalasi è stata rilevata nel virus HSV-1 ma non nei capsidi HAd2, VSV o HSV-1 A. Il pannello c mostra i risultati dell’analisi del gradiente di densità del saccarosio. Un totale di 50 µg di HSV-1 purificato in 50 µl di TNE è stato centrifugato su un gradiente di 600 µl del 20% al 50% di saccarosio in TNE. La centrifugazione è stato per 45 min a 22.000 giri / min in un Beckman SW55 rotore a 4°C. Il gradiente è stato frazionato e singole frazioni sono stati analizzati mediante SDS-PAGE) seguita tamponando su difluoruro di polivinilidene (PVDF) e colorazione con 1% Ponceau S. La macchia è stata poi destained e colorate con anticorpi specifici per la catalasi (che la migrazione casualmente con standard catalasi; Worthington LS001872). Si noti che la posizione del virus nel gradiente (riga superiore) coincide con quella della catalasi (riga inferiore), suggerendo che i due sono associati.

Sono stati condotti esperimenti di controllo per confermare che la catalasi era associata all’HSV-1 e non alle impurità presenti nella preparazione del virus. L’HSV-1 purificato è stato centrifugato in una banda su un gradiente di densità di saccarosio, il gradiente è stato frazionato e l’analisi Western blot è stata utilizzata per testare le singole frazioni di gradiente per la presenza di catalasi. I risultati hanno mostrato che la catalasi era presente nelle frazioni contenenti virus ma non in quelle di accompagnamento (Fig. 1c). I risultati sono interpretati per indicare che la catalasi è associata a HSV-1 e non a contaminanti, come batteri contenenti catalasi o materiali delle cellule ospiti nella preparazione del virus. Poiché il genoma HSV-1 non codifica la catalasi (22), l’enzima associato al virus deve essere derivato dalla cellula ospite. I primi studi sul virus vaccinia hanno dimostrato la presenza di catalasi all’interno del virione maturo (8). Oltre a questa osservazione, non sappiamo di nessun altro rapporto di catalasi come componente di una struttura del virus.

Ulteriori analisi della catalasi associata a HSV-1 miravano a determinare la posizione dell’enzima nel virione. Sono stati fatti due tipi di esperimenti. In primo luogo, il virus purificato è stato trattato con l’enzima proteolitico pronasi per degradare le glicoproteine del virus e tutte le proteine non contenute all’interno della membrana del virione. Ci si aspettava che le proteine virali interne non fossero influenzate, poiché pronase non attraversa il doppio strato lipidico del virus (16). Dopo il trattamento con pronasi, il virus è stato raccolto mediante centrifugazione e l’entità della perdita di catalasi è stata determinata dall’analisi Western blot. I risultati non hanno mostrato alcuna evidenza di perdita di catalasi in due concentrazioni di virus testati (vedere la banda di catalasi in Fig. 2a, corsie 1 e 2). I controlli interni hanno dimostrato che le glicoproteine di superficie del virus gB e gH sono state scisse come previsto (Fig. 2a; confrontare le corsie 2 e 3). Allo stesso modo, l’analisi Western blot ha dimostrato che la glicoproteina D HSV-1 è stata digerita dalla pronasi o dalla tripsina in condizioni in cui la catalasi non è stata influenzata (Fig. 2 ter). Anche la catalasi purificata in soluzione è stata digerita nelle stesse condizioni. Al contrario, nessuna degradazione del tegumento interno (UL47, UL48 e UL49) o delle proteine del capside (UL19, UL38, UL18; Fig. 2a, corsie 1 e 2) è stato osservato. I risultati sono interpretati per indicare che catalasi si trova all’interno della busta HSV-1.

Localizzazione della catalasi in HSV-1 mediante trattamento di virioni purificati con pronasi (corsie da 1 a 3) e Triton X-100 (a, corsie 4 e 5) e mediante trattamento con pronasi e tripsina (b, corsie da 1 a 3). Il pannello a mostra l’analisi di SDS-PAGE e Western blot delle proteine presenti nell’HSV-1 intatto (corsie 3 e 4) e nei virioni dopo il trattamento con pronase (corsie 1 e 2) e Triton X-100 (corsia 5). Si noti che la catalasi è stata trovata presente nei virioni intatti (corsie 3 e 4) e nei virioni trattati con pronasi (corsie 1 e 2) ma non nei virioni dopo trattamento con 1% Triton X-100 (corsia 5). Il trattamento con pronasi è stato effettuato digerendo HSV-1 purificato (0,25 mg / ml) con 1 mg / ml pronasi (Streptomyces griseus; Calbiochem 537088) per 4 ore a 37°C. Dopo il trattamento con pronasi, il virus è stato riisolato mediante centrifugazione del gradiente di densità del saccarosio prima dell’analisi SDS-PAGE e Western blot. Il trattamento con Triton X-100 è stato eseguito regolando il virus purificato all ‘ 1% di Triton X-100 in tampone TNE contenente ditiotreitolo da 10 mm (DTT) e incubando per 15 minuti su ghiaccio (4°C). I capsidi risultanti sono stati quindi purificati mediante centrifugazione a gradiente di saccarosio prima dell’analisi SDS-PAGE e Western blot. (b) Analisi Western blot di HSV-1 purificato dopo trattamento in vitro con pronasi o tripsina. Un totale di 100 µl di HSV-1 purificato (1 mg / ml) è stato aggiustato a 2 mg/ml di pronasi o 2 mg/ml di tripsina. Un’incubazione di controllo non aveva enzima. Le miscele sono state incubate per 2 ore a 37°C e i virioni sono stati purificati lontano dagli enzimi mediante centrifugazione su un gradiente di saccarosio dal 20% al 50% come descritto nella legenda di Fig. 1. I campioni di virus sono stati pellettati mediante centrifugazione ed esaminati mediante analisi SDS-PAGE e Western blot. Le macchie sono state macchiate per catalasi (coniglio policlonale; vedi sopra) e glicoproteina D (anticorpo monoclonale di topo DL11; un regalo di Gary Cohen e Roselyn Eisenberg; 1:5,000). Si noti che il trattamento con proteasi ha causato la digestione della glicoproteina D, ma non della catalasi, indicando che la catalasi si trova all’interno della membrana HSV-1.

Una definizione più precisa per la posizione della catalasi è stata ottenuta trattando il virus purificato con il detergente non ionico Triton X-100 (TX-100). Una volta effettuato con il virus fresco, questo trattamento causa la perdita della membrana del virus, delle glicoproteine della membrana e di quasi tutte le 20 o più proteine del tegumento (tutti tranne UL36, UL37 e US3) (13, 21, 27). Il capside mantiene la sua integrità, tuttavia, e nessuna delle principali proteine del capside viene persa. Il DNA del virus viene trattenuto all’interno del capside. Gli esperimenti hanno coinvolto il trattamento di HSV-1 con 1% TX-100 e l’isolamento dei capsidi risultanti mediante centrifugazione del gradiente di densità del saccarosio. L’analisi Western blot è stata quindi utilizzata per testare i capsidi per la presenza di catalasi. I risultati hanno dimostrato che le glicoproteine virali e le proteine tegumentali sono state rimosse come previsto e che anche la catalasi è stata rimossa (vedere Fig. 2a, corsie 4 e 5). Questo esperimento è interpretato per indicare che la catalasi è presente nel tegumento HSV-1.

Informazioni come quella mostrata in Fig. 2 può essere utilizzato per determinare il numero di molecole di catalasi per virione HSV-1 (15). Questa misurazione è stata effettuata a partire da due aliquote identiche di virus purificato. I due sono stati utilizzati per la determinazione di (i) il numero di molecole proteiche principali del capside (UL19) da un gel colorato di blu di Coomassie e (ii) il numero di molecole di catalasi 60-kDa da un Western blot calibrato. In una determinazione rappresentativa, questa analisi ha prodotto un valore di 1: 207,5 per il rapporto molare tra catalasi e UL19. Poiché ci sono 955 molecole UL19 per capside HSV-1, il numero di molecole di catalasi per capside è stato determinato come 955/207.5 o 4.6. Una seconda determinazione simile ha prodotto un valore di 7,1 molecole di catalasi. Poiché ci sono quattro subunità 60-kDa in una molecola catalasi attiva (11, 20), i risultati indicano la presenza di 1 a 2 tetrameri catalasi per virione.

La presenza di catalasi all’interno del virione HSV-1 suggerisce la possibilità che possa essere coinvolta nella protezione del virus dal danno ossidativo da parte di H2O2. In alternativa, la catalasi può essere incorporata passivamente in HSV-1 poiché il tegumento viene aggiunto nel citoplasma della cellula ospite e non ha alcuna funzione protettiva. Per distinguere tra le due possibilità, abbiamo esaminato la sensibilità dell’HSV-1 purificato all’inattivazione da parte di H2O2IN vitro. HSV-1 è stato trattato con H2O2 in presenza o assenza dell’inibitore della catalasi sodio azide (NaN3) e il titolo del virus è stato determinato successivamente (in assenza di inibitore della catalasi). I risultati hanno mostrato che mentre 50 mM H2O2 producevano una modesta diminuzione del titolo (da 3 a 4 volte), un effetto letale di 106 volte o superiore è stato osservato se NaN3 era presente (Tabella 1). Gli esperimenti di controllo hanno mostrato una scarsa uccisione di HSV-1 da parte di NaN3 da solo (Tabella 1). I risultati sono interpretati per indicare che catalasi fornisce un livello significativo di protezione contro l’inattivazione di HSV-1 da parte di H2O2.

Non è previsto che HSV-1 debba essere protetto dal danno ossidativo da H2O2 mentre è associato a una cellula ospite. Come descritto sopra, un ambiente riducente è trovato all’interno della cellula e che impedirebbe la formazione di H2O2. Al di fuori della cellula ospite, tuttavia, l’ambiente è ossidante, in grado di produrre H2O2 sia all’interno del virus che nel mezzo circostante. HSV-1 incontrerebbe questo ambiente mentre viene trasmesso da un host all’altro e la catalasi potrebbe essere coinvolta nella protezione dell’infettività HSV-1 durante il transito. HSV-1-catalasi associata può anche fornire protezione da H2O2 prodotto da batteri commensali o altre fonti. L’H2O2 prodotto dai lattobacilli, ad esempio, ha dimostrato di proteggere il tratto genitale femminile da malattie dovute a infezioni microbiche (4). A causa del suo alto tasso catalitico, la catalasi associata al virus potrebbe avere un ruolo nella protezione di HSV-1 nonostante il suo basso numero di copie (da 1 a 2 copie per virione). La catalasi epatica, ad esempio, è in grado di disintossicare decine di milioni di molecole di H2O2 al secondo, tra le più alte percentuali catalitiche riportate per qualsiasi enzima (2).

Tutti i virus della famiglia dell’herpes hanno un tegumento, uno strato di proteine che si trova tra il capside del virus e la membrana (5, 6, 9, 13). Il tegumento HSV-1 ha uno spessore da 40 a 50 nm e consiste di circa 20 specie proteiche distinte, quasi tutte codificate nel genoma del virus. Le proteine tegumenti differiscono sostanzialmente nella loro abbondanza nel virione con 800 copie o più delle specie principali, come UL47, UL48 e UL49 (vedi Fig. 2a, corsia 3) (5, 16). Molte proteine tegumenti sono coinvolte nelle fasi iniziali della replicazione HSV-1, come l’attivazione della trascrizione genica precoce e l’attenuazione della sintesi proteica delle cellule ospiti (13, 24, 25). Il tegumento è assemblato nel nascente virione HSV-1 come gemme capside contenenti DNA in una vescicola della rete trans-Golgi (10). Si suggerisce che la catalasi sia incorporata insieme ad altre proteine tegumenti durante il processo di germogliamento.

Nelle cellule non infette, la maggior parte della catalasi si trova sequestrata nei perossisomi (26). Affinché possa essere incorporato nella progenie HSV-1 durante la tegumentazione come descritto sopra, la catalasi dovrebbe essere rilasciata dai perossisomi. Suggeriamo che ciò possa avvenire come conseguenza del riarrangiamento su larga scala delle membrane citoplasmatiche che accompagna la replicazione HSV-1 (1).

Palamara et al. (19) hanno dimostrato che una diminuzione della concentrazione di glutatione citoplasmatico si verifica immediatamente dopo che le cellule Vero sono state infettate con HSV-1. Si prevede che una diminuzione della concentrazione di glutatione causi una diminuzione del potenziale di riduzione citosolica e questa diminuzione sembra potenziare la replicazione HSV-1. Il glutatione extra fornito nel mezzo di crescita è stato trovato per antagonizzare la crescita HSV-1 (19). Come glutatione aggiunto esternamente, la catalasi citosolica può aumentare il potenziale riducente del citoplasma rimuovendo H2O2. Si suggerisce, quindi, che una conseguenza dell’incorporazione della catalasi nei virioni della progenie possa essere quella di potenziare la crescita del virus privando le cellule infette della catalasi.

Il piccolo numero di molecole di catalasi per virione può spiegare perché non è stato rilevato in un’analisi spettrometrica di massa di interi virioni HSV-1 (7). Ci sono diverse proteine di virione HSV-1 ad alto numero di copia che potrebbero oscurare il segnale dalla catalasi (ad esempio, ci sono migliaia di copie di molecole di glicoproteina e 955 copie della proteina principale del capside ). L’abbondanza di catalasi non soddisfa lo standard informale per il rilevamento mediante spettrometria di massa (visibilità su un gel SDS-PAGE macchiato di Coomassie). La perossiredossina, una proteina perossisomiale con attività antiossidante, è stata rilevata nell’analisi spettrometrica di massa di HSV-1 (7, 26).

In futuro, potrebbe essere possibile sfruttare la sensibilità di HSV-1 agli effetti citotossici di H2O2. Si prevede che il virus sarebbe particolarmente vulnerabile quando si trova in un ambiente ossidante al di fuori della cellula ospite e quando la catalasi è inibita.