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着床前遺伝子診断

by admin

PGDは、着床前に行われる遺伝子診断の一形態である。 これは、患者の卵母細胞がin vitroで受精され、胚が診断が確立されるまで培養中に保持されるべきであることを意味する。 診断を行うための材料を得るために、これらの胚に対して生検を行うことも必要である。 診断自体は、研究された状態の性質に応じて、いくつかの技術を用いて行うことができる。 一般に、PCRベースの方法は染色体異常のmonogenic無秩序および魚のためにそしてPCRの議定書がXリンクされた病気のために利用できないそれらのケースを性 これらの技術は、割球上で実施されるように適合させる必要があり、臨床使用前に単細胞モデルで完全に試験する必要がある。 最後に、胚の取り替えの後で、残りの良質の変化していない胚は次の周期で分解され、戻って移すためにcryopreservedできます。

胚の取得edit

現在、すべてのPGD胚は生殖補助技術によって取得されていますが、自然サイクルとin vivo受精の使用に続いて子宮洗浄が試みられ、現在は大部分が放棄されています。 卵母細胞の大規模なグループを得るために、患者は制御された卵巣刺激（COH）を受ける。 COHは、ヒト更年期性ゴナドトロフィン（hMG）または組換え卵胞刺激ホルモン（FSH）と組み合わせた下垂体脱感作のためのゴナドトロフィン放出ホルモン（GnRH）類似体を用いたアゴニストプロトコル、または患者のプロファイル（年齢、体格指数（bmi）、内分泌パラメータ）の臨床評価に従ってGnRHアンタゴニストと組み合わせた組換えFSHを用いたアンタゴニストプロトコルのいずれかで行われる。 hCGは、経膣超音波スキャンで平均直径17mm以上の少なくとも三つの卵胞が見られる場合に投与される。 経膣超音波ガイド卵母細胞の検索は、hCG投与の36時間後に予定されています。 黄体期の補充は、600μ gの天然微粉化プロゲステロンの毎日の膣内投与からなる。PCRベースの技術が使用されている場合、これらの細胞はPGD中の汚染源となり得るため、卵母細胞は積雲細胞から慎重に脱色される。

卵母細胞は 報告されたサイクルの大部分では、IVFの代わりに細胞質内精子注入（ICSI）が使用される。 主な理由は，透明帯に付着した残留精子による汚染を防止し，予期せぬ受精障害を避けることである。 ICSI手順は、成熟中期II卵母細胞で行われ、受精は16-18時間後に評価される。 胚の発達は、生検の前および女性の子宮に移されるまで、毎日さらに評価される。 切断の段階の間に、胚の評価は割球の数、サイズ、細胞形および分裂率に基づいて毎日行われます。 4日目に、胚は圧縮の程度の機能で採点され、胚盤胞はthrophectodermおよび内部細胞塊の質、および拡張の程度に従って評価された。

生検手順編集

PGDは、異なる発達段階からの細胞に対して行うことができるように、生検手順はそれに応じて異なります。 理論的には、生検はすべての着床前段階で行うことができますが、3つだけが示唆されています: 未受精卵および受精した卵母細胞（極性体、PBsの場合）、三日目の切断段階の胚（割球の場合）および割胞（栄養外胚葉細胞の場合）。

生検の手順は、常に透明帯の開口部と細胞の除去の2つのステップを含む。 Pbsおよび割球の取り外しのためのpellucida帯の違反のための機械、化学、および物理的な（Tyrodeの酸性解決）およびレーザー技術、放出または抱負、およびtrophectodermの細胞のherniation

Polar body biopsyEdit

Main article:Polar body biopsy

polar body biopsyは、卵形成中に卵細胞として同時に形成される小さな一倍体細胞であるが、一般的に受精する能力を持たない極性体のサンプリングである。 胚盤胞生検と比較して、極体生検は、潜在的に低コスト、より少ない有害な副作用、および異常の検出においてより敏感であり得る。 従ってPGDの北極ボディの使用の主な利点はそれらが巧妙な受精か正常な萌芽期の開発に必要ではないことであり、胚のための有害な効果を保障し PB生検の欠点の一つは、それが唯一の胚への母体の貢献についての情報を提供することであり、排他的に母性送信されている母性遺伝常染色体優性およ 別の欠点は、例えば、遺伝物質の分解またはヘテロ接合性の第一極性体につながる組換えの事象による診断エラーのリスクの増加である。

開裂ステージ生検（胚盤胞生検）編集

開裂ステージ生検は、通常、胚が正常に発達している八細胞期に達すると、受精後三日目の朝に行われる。 生検は、通常、50％未満の無核断片を有する胚および8細胞またはそれ以降の発達段階で行われる。 透明帯に穴が作られ、核を含む一つまたは二つの割球が静かに吸引または開口部を介して押出されます。PB分析よりも切断段階の生検の主な利点は、両方の親の遺伝的入力を研究することができるということです。 一方、切断段階の胚は染色体モザイクの割合が高いことが判明し、一つまたは二つの割球で得られた結果が胚の残りの部分を代表するかどうかが疑問 このため、一部のプログラムでは、PB生検と胚盤胞生検の組み合わせを利用しています。 さらに、切断段階の生検は、ＰＢ生検の場合のように、診断のための組織の非常に限られた量をもたらし、単一細胞ＰＣＲおよびＦＩＳＨ技術の開発を必要とする。理論的にはPB生検および胚盤胞生検は切断期生検よりも有害ではないが、これは依然として一般的な方法である。 これは、ESHRE PGD Consortiumに報告されたPGDサイクルの約94％で使用されています。 主な理由は、PB生検よりも安全で完全な診断が可能であり、胚盤胞生検とは異なり、胚を患者の子宮内で交換しなければならない前に診断を終了するのに十分な時間を残すことである。すべての切断段階のうち、生検のための最適な瞬間は八細胞段階にあることが一般的に合意されている。 これは、PB生検よりも診断的に安全であり、胚盤胞生検とは異なり、5日目の前に胚の診断を可能にする。 この段階では、細胞はまだ全能性であり、胚はまだ圧縮されていない。 ヒト胚の四分の一までは、その開発を中断することなく除去することができることが示されているが、それはまだ一つまたは二つの細胞の生検は、

胚および/または胚盤胞の幸福は、生検に使用される手順によって影響を受ける可能性があるため、透明帯を開くすべての方法が同じ成功率を有 酸性チロド溶液（Ｚ Ｄ）によるゾナ掘削を部分ゾナ解剖（ＰＺＤ）と比較して調べ，どの技術がより成功した妊娠につながり，胚および／またははい割球に対する影響が少ないかを決定した。 ZDはそれに化学鋭い方法をするpronaseのような消化酵素を使用します。 ZDで使用される化学物質は、胚に有害な影響を及ぼす可能性があります。 PZDはそれに普通巧みな手がプロシージャを行うことを必要とする機械解剖方法をする帯のpellucidaを切るのにガラスmicroneedleを使用する。 71のカップルを含んでいた調査では、ZDは26のカップルからの19の周期で行われ、PZDは59のカップルからの52の周期で行われました。 単一細胞分析では、PZD群で87.5％、ZD群で85.4％の成功率があった。 母親の年齢、取り出した卵母細胞の数、受精率、および他の変数は、ZD群とPZD群の間で差はなかった。 PZDは、ZDよりも有意に高い妊娠率（40.7％対15.4％）、進行中の妊娠（35.6％対11.5％）、および移植（18.1％対5.7％）をもたらしたことが判明した。 これは，着床前遺伝子診断のためのはい核生検におけるＰＺＤの機械的方法を使用することは，ＺＤの化学的方法を使用するよりも熟練していることを示唆している。 ＺＤに対するＰＺＤの成功は，はいおよび／またははい割球に有害な影響を及ぼすＺＤ中の化学物質に起因する可能性がある。 現在、レーザーを使用した帯状疱疹の訓練はpellucida帯状疱疹を開ける支配的な方法です。 レーザーを使用すると、機械的または化学的手段を使用するよりも簡単な技術です。 しかし、レーザー掘削は胚に有害である可能性があり、特にPGDが現代のように普及しているプロセスではない場合には、体外受精実験室が使用することは非常に高価である。 PZDは、これらの問題の実行可能な代替手段である可能性があります。

胚盤胞生検edit

単一細胞技術に関連する困難を克服するために、胚盤胞の段階で胚を生検し、診断のためのより多くの出発物質を提供するこ 同じ試料管に２つ以上の細胞が存在する場合、単一細胞ＰＣＲまたはＦＩＳＨの主要な技術的問題は事実上消滅することが示されている。 一方，開裂期生検の場合と同様に，内部細胞塊と栄養外胚葉（Ｔ ｅ）との染色体差は診断の精度を低下させる可能性があるが，このモザイクは開裂期はいよりも低いことが報告されている。

TE生検は、ウサギ、マウス、霊長類などの動物モデルで成功していることが示されています。 これらの研究は、いくつかのＴＥ細胞の除去が、胚のさらなるｉｎ ｖｉｖｏ発生に有害ではないことを示す。

PGDのヒト胚盤胞期生検は、in vitro培養の三日目にZPに穴を開けることによって行われる。 これは成長のTEがblastulationの後で突出するようにしま生検を促進します。 受精後5日目に、約5つの細胞をガラス針またはレーザーエネルギーを用いてTEから切除し、胚を大部分無傷で、内部細胞塊を失うことなく残す。 診断後、胚は同じサイクルの間に交換することができ、またはその後のサイクルで凍結保存され、移送されることができる。このアプローチには、それが実行される段階のために二つの欠点があります。

第一に、着床前胚の約半分のみが胚盤胞期に達する。 これは、生検のために利用可能な胚盤胞の数を制限することができ、場合によってはPGDの成功を制限する。 Mc Arthurらは、開始されたPGDサイクルの21％にTE生検に適した胚がなかったことを報告している。 この数字は、ESHRE PGD consortiumデータによって提示された平均よりも約4倍高く、PBおよび切断段階の生検が主に報告されている方法である。 一方、生検を発達のこの後期に遅らせることは、遺伝子診断を行う時間を制限し、胚を患者に戻す前にPCRの第二ラウンドをやり直すか、またはFISHプローブを再ハイブリダイズすることを困難にする。

積雲細胞samplingEdit

積雲細胞のサンプリングは、胚からの極体または細胞のサンプリングに加えて行うことができます。 卵丘細胞と卵母細胞の間の分子相互作用のために、卵丘細胞の遺伝子発現プロファイリングは、卵母細胞の品質と卵巣過剰刺激プロトコルの効率を推定するために行うことができ、間接的に異数性、胚の発生と妊娠転帰を予測することができます。

非侵襲的着床前遺伝子スクリーニング法（NIPGS）編集

伝統的な胚生検は、侵襲的かつ高価なことができます。 したがって、研究者は、着床前遺伝子検査のためのより侵襲性の低い方法を見つけるための継続的な探求を持っています。 胚盤胞液や使用済み胚培地などの新しい非侵襲的着床前遺伝学スクリーニング法（NIPGS）に関する研究は、最近、伝統的な方法の代替として公開されています

着床前遺伝学スクリーニング胚盤胞液（BF）を用いた検査通常のIVFプロセス中に、胚をガラス化する良い習慣は、健康な妊娠の可能性を高める。 ガラス化のプロセスの間に開発された送風は水分を取り除かれ、それおよびblastocoelキャビティは凍結プロセスのために崩壊する。 レーザーパルス、反復マイクロピペッティング、マイクロニードル穿刺またはマイクロサクションを含む崩壊を容易にするために使用されてきた多くの方法があります通常、この流体は廃棄されますが、BLの着床前遺伝子検査では、この流体は保存され、DNAについて試験されます。 このDNAは、発生中の胚で見つかったアポトーシスを経た細胞からのものであると考えられています

胚盤胞培養条件培地（BCCM）を用いた着床前遺伝子検査 胚は、潜伏期内に死亡した細胞からＤＮＡ断片を放出することが注目されている。 この知識で、科学者たちは、彼らがこのDNAを分離し、着床前遺伝子検査のためにそれを使用することができると推論している

低侵襲着床前遺伝子検査の利点と結果着床前遺伝子検査のより伝統的な方法が胚に有害であるかどうかについて矛盾する証拠がありますが、より侵襲性の低い、同等に効果的な検査方法のための新しい方法があります。 そのために、我々は胚盤胞液と使用済み胚培地を用いた着床前遺伝子検査に目を向けました。 これらの代替案の1つの問題は、最小限の量のDNAを使用することです。 もう一つの非常に重要な質問は、この技術が正確であるかどうかです。 これらの懸念の両方が最近Kuznyetsovによって対処されました。 Kuznyetsovは、両方の技術から取得されたDNAの量を組み合わせた両方の方法を使用することにしました。 その後、DNAが単離された後、それは着床前遺伝子検査のために使用された。 結果は、両方の方法胚盤胞液と胚使用培地を組み合わせて使用したとき、彼らは87の全染色体コピーのためのコーダンスレートを示したことを示した。栄養外胚葉と比較した場合には5％、胚盤胞全体と比較した場合には96.4％（金本位制）である。 さらに、この新しい方法を用いて増幅した後、それらは、サンプル当たり25.0〜54.0ng/ulのDNAを生成することができた。 このようなtrophectodermなどの伝統的な方法で、彼らは10-44ng/ulを収集しました

遺伝子解析techniquesEdit

蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）とポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、PGDで一般的に使用されている第一世代の技術である。 PCRは、一般的に単遺伝子障害を診断するために使用され、FISHは染色体異常（例えば、異数性スクリーニングまたは染色体転座）の検出のために使用される。 過去数年間、PGDテストの様々な進歩は、使用される技術に応じて利用可能な結果の包括性と精度の向上を可能にしてきました。 最近、単一の割球から中期プレートを固定することを可能にする方法が開発された。 この技術は、FISHと組み合わせて、m-FISHは、解析が中期プレート全体で行われるため、より信頼性の高い結果を生成することができます

FISHおよびPCRに加えて、単 これは、胚のゲノムの完全なDNA配列を特徴付ける。

FISHEdit

FISHは、胚の染色体構成を決定するために最も一般的に適用される方法です。 核型とは対照的に、それはPBs、割球およびTEサンプルで使用することができるように、間期染色体で使用することができます。 細胞はガラス顕微鏡のスライドで固定され、DNAの調査とハイブリダイゼーションされる。 これらのプローブのそれぞれは、染色体の一部に特異的であり、蛍光色素で標識されている。

Dual FISHは、ヒト着床前胚の性別を決定するための効率的な技術であり、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を介しては不可能な異常な染色体コピー数を検出する

現在、プローブの大きなパネルは、すべての染色体の異なるセグメントのために利用可能ですが、異なる蛍光色素の限られた数は、同時に分析するこ

サンプルに使用されるプローブの種類と数は、表示に依存します。

性決定のために（例えば、所与のX連鎖障害のPCRプロトコルが利用できない場合に使用される）、XおよびY染色体のプローブは、内部FISHコントロールとして常染色体の一つまたは複数のプローブとともに適用される。 異数性、特に実行可能な妊娠を引き起こす可能性のあるプローブ（トリソミー21など）をチェックするために、より多くのプローブを追加することができます。 染色体X、Yのためのプローブの使用, 13, 14, 15, 16, 18, 21 そして22に自発の中絶で見つけられる異数性の70%を検出する潜在性があります。

同じサンプル上のより多くの染色体を分析できるようにするために、魚の三つの連続したラウンドまで行うことができます。

同じサンプル上のより多くの染色体を分析できるようにするために、魚の三つ 染色体再配列の場合、関心領域の側面にあるプローブの特定の組み合わせを選択する必要があります。 魚の技術は5と10％の間の誤り率を持っていると考えられています。

胚の染色体構成を研究するための魚の使用の主な問題は、ヒトの着床前段階で観察されるモザイク率の上昇である。 800以上の胚のメタアナリシスは、着床前胚の約75％がモザイクであり、そのうち約60％が二倍体-異数体モザイクおよび約15％の異数体モザイクであるという結果になった。 Liと共同研究者は、3日目に異数体と診断された胚の40％が6日目に異数体の内部細胞塊を有することが判明したことを見出した。 Staessenと共同研究者は、pgs中に異常と診断され、PGD後の再解析を受けた胚の17.5％が正常細胞を含むことが判明し、8.4％が著しく正常であることが判明した。 結果として、胚から研究された一つまたは二つの細胞が実際に完全な胚の代表であるかどうか、および生存可能な胚が技術の限界のために廃棄されていないかどうかが疑問視されている。

PCREdit

Kary Mullisは、DNA複製のin vivoプロセスのin vitro単純化された再生として1985年にPCRを考案しました。 DNAの化学的性質と耐熱性DNAポリメラーゼの利用可能性を利用して、PCRは、特定の配列のためのDNAサンプルの濃縮を可能にする。 PCRは、ゲノムの特定のストレッチのコピーを大量に取得する可能性を提供し、さらなる分析を可能にする。 それをPGDを含むいろいろな種類の遺伝子診断のために適したようにするのは感度が高く、特定の技術です。 現在、ＰＣＲ産物の事後分析のための様々な方法だけでなく、ＰＣＲ自体にも多くの異なるバリエーションが存在する。

PGDでPCRを使用する場合、日常的な遺伝子解析には存在しない問題、すなわち利用可能なゲノムDNAの微量に直面しています。 ＰＧＤは、単一細胞上で実施されるので、ＰＣＲは、適応され、その物理的限界に押し込まれ、可能な限り最小量の鋳型を使用しなければならない：これは、１本鎖であ これは、PCR条件の微調整の長いプロセスと、従来のPCRのすべての問題に対する感受性を意味するが、いくつかの程度が激化した。 必要なPCRサイクルの数が多く、テンプレートの量が限られているため、シングルセルPCRは汚染に非常に敏感です。 単一細胞PCRに特異的な別の問題は、対立遺伝子ドロップアウト（ADO）現象である。 これは、ヘテロ接合性試料中に存在する対立遺伝子の一つのランダムな非増幅からなる。 Adoは、ヘテロ接合胚がどの対立遺伝子が増幅に失敗するかに応じて影響を受けるか影響を受けないと診断される可能性があるため、PGDの信頼性を真剣に妥協している。 これは影響を受けた対立遺伝子のADOが影響を受けた胚の移動をもたらすことができるautosomal支配的な無秩序のためのPGDで特に関連しています。

いくつかのPCRベースのアッセイは、単一のヒト体細胞、配偶子および胚における筋強直性ジストロフィーおよび脆弱Xに関連する三重項リピート遺伝子

NGSEdit

2014年から、PGTで次世代シーケンシング（NGS）が行われています。 Ngsは、massive parallel sequencingとしても知られており、合理的なコストと時間で大量のDNAを配列決定することができる技術のグループです。 それは私たちにミトコンドリアのものを含む完全な胚ゲノムの一般的な視点を与えることができます。 これらの技術は、それぞれ約400塩基の短い読み取りをシーケンシングし、これらの読み取りを強力なアライメントソフ同様に、NGSはまた、キャリア親からの徴候がある場合に、24本の染色体および単一遺伝子欠損における異数性を検出することを可能にする。

主な利点は、NGSが異数性および単原性疾患の両方の検出を単一の生検と組み合わせることができ、手頃な価格のコストを削減し、よりアクセスしやす

NGSの二つの例は、パイロシークエンスと可逆色素ターミネーターです。

診断の確立編集

PGDでの診断の確立は必ずしも簡単ではありません。 FISHまたはPCR結果の後に交換される胚を選択するために使用される基準は、すべてのセンターで同じではありません。魚の場合、いくつかのセンターでは、一つまたは二つの割球を分析した後、染色体的に正常であることが判明した胚（すなわち、ゴノソームと分析された常染色体の二つのシグナルを示す）のみが置換され、二つの割球が分析されるとき、結果は一致するはずである。 他のセンターは、偽のモノソミー（すなわち、正常な二倍体細胞における一つの魚の信号の損失）が最も頻繁に発生する誤診であるため、モノソミーと診断された胚は、転送することができると主張しています。 これらの場合、異数体妊娠のリスクはなく、正常な二倍体胚は魚の誤りのために移植のために失われない。 さらに、3日目（染色体Xおよび21を除く）に単分体と診断された胚は、胚盤胞に発達することはなく、これらの単分体は進行中の妊娠では観察されなPCRを用いたPGDにおける診断と誤診は、NavidiとArnheimとLewisと共同研究者の研究で数学的にモデル化されています。

PCRを用いたPGDの診断と誤診は、NavidiとArnheimとLewisと共同研究者の これらの出版物の最も重要な結論は、胚の効率的かつ正確な診断のためには、二つの遺伝子型が必要であるということである。 これは、連結されたマーカーおよび単一細胞からの疾患遺伝子型、または２つの細胞のマーカー／疾患遺伝子型に基づくことができる。 これらの論文で検討されている興味深い側面は、特定の胚のPCR結果に現れる可能性のある対立遺伝子のすべての可能な組み合わせの詳細な研究で 著者らは、診断中に得られる遺伝子型のいくつかは、リンクされたマーカー遺伝子型の予想されるパターンと一致しないかもしれないが、まだ胚の影響を受け これらのモデルは安心ですが、理論モデルに基づいており、一般的に診断は誤診の可能性を避けることを目指して、より保守的に確立されています。 細胞の分析中に予期しない対立遺伝子が現れた場合、観察された遺伝子型に応じて、異常な細胞が分析されたか、または汚染が発生したと考えられ、診断は確立されないと考えられる。 分析された細胞の異常が明確に識別できる場合は、リンクされたマーカーのための多重PCRを使用して、親のいずれかの対立遺伝子のみがサンプル中に見 この場合、細胞は、マーカーが配置されている染色体のモノソミー、またはおそらく一倍体としてのモノソミーを有すると考えることができる。 罹患した遺伝子型を示す単一の対立遺伝子の出現は、罹患した胚を診断するのに十分であると考えられ、完全な罹患していない遺伝子型と診断された胚は、置換のために好ましい。 このポリシーは、転送に適した影響を受けない胚の数が少ないにつながる可能性がありますが、誤診の可能性よりも好ましいと考えられています。

移植前の遺伝的ハプロタイプ編集

主な記事: 着床前遺伝的ハプロタイプ

着床前遺伝的ハプロタイプ（PGH）は、疾患の原因となる突然変異ではなく、標的疾患に統計的関連を有する遺伝子マーカーのハプロタイプが同定されるPGD技術である。関連する遺伝子マーカーのパネルが特定の疾患について確立されると、その疾患のすべてのキャリアに使用することができます。

対照的に、単一遺伝子疾患であっても、罹患遺伝子内の多くの異なる変異によって引き起こされる可能性があるため、特定の変異を見つけることに基づ したがって、PGHは、変異特異的試験が利用できない場合にPGDの可用性を広げます。

PGHはまた、魚は通常、染色体転座のバランスのとれた形態を有する胚と相同正常染色体を有する胚との間の分化を行うことができないという点で、魚 この無力はなされる診断に真剣に有害である場合もあります。 PGHは、魚がしばしばできない区別をすることができます。 PGHは、転座の認識に適した多型マーカーを使用することによってこれを行います。 これらの多型マーカーは、正常、バランスのとれた、および不均衡な転座を運んだ胚を区別することができます。 魚はまたPGHがポリメラーゼの連鎖反応の管に細胞の移動だけを要求する一方分析のためにより多くの細胞の固定を要求する。 細胞の移動はより簡単な方法で、分析の失敗のためのより少ない部屋を残す。

胚移植と余剰胚の凍結保存edit

胚移植は、通常、PGDに使用される技術とそれが行われるIVFセンターの標準的な手順に応じて、受精後三日目または五日目

ART後の多胎妊娠の発生率の減少を目的とした単一胚移植政策のヨーロッパでの導入により、通常、一つの胚または早期胚盤胞が子宮内で置換される。 血清ｈＣＧは、１ ２日目に決定される。 妊娠が確立された場合、胎児の心拍の存在を確認するために7週間の超音波検査が行われる。 カップルは一般に誤診の、低いとはいえ、危険のためにPNDを経るように助言されます。

PGDの後に、必要以上に女性に戻すのに適した胚が多いことは珍しいことではありません。 PGDを受けているカップルのために、これらの胚は、カップルの現在のサイクルが進行中の妊娠につながらない可能性があるため、非常に貴重です。 胚の凍結保存とその後の解凍と置換は、面倒で高価なARTおよびPGD手順をやり直すことなく、妊娠の二度目のチャンスを与えることができます。