酵素アッセイ（a）、ウェスタンブロット分析（b）、およびスクロース密度勾配遠心分離（c）によるHSV-1関連カタラーゼの同定。 パネルａは、溶液を１％Ｈ２Ｏ２に調整した２ ０分後に精製Ｈ ＳＶ−１を含む管（左の管）およびＨ２Ｏ２の前にカタラーゼ阻害剤（２ｍ Ｍアジ化ナトリウム）を添加した ウイルス中のカタラーゼの存在を示す、左チューブ内の気泡の形成に注意してください。 ウイルス濃度は、TNE中0.25mg/ml（0.01M Tris-HCl、0.5M NaCl、1mM EDTA、pH7.5）であり、インキュベーションは室温であった。 ウイルスは、ＶＥＲＯ細胞の単層培養物上で増殖させ、ショ糖密度勾配遠心分離によって精製したＨＳＶ−１のＫＯＳ株であり、力価は、先に記載された（１ ４）のように端点希釈 パネルｂは、ＨＳＶ−１、ヒトアデノウイルス２（Ｈａｄ２）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳ Ｖ）、およびＨＳＶ−１ａカプシドにおけるカタラーゼの存在についてのウェスタンブロット ヒトアデノウイルス2と水疱性口内炎ウイルス（; Ｓａｎ Ｊｕａｎ株）を、それぞれＨ ＥｌａおよびＶｅｒｏ細胞の単層培養物上で増殖させ、以前に記載された手順（１ ２、１ ７）によって精製した。 公表された方法はまた、ＨＳＶ−１ａおよびｂカプシドの精製のために使用された（２ ３）。 主要なキャプシドタンパク質は、ブロットを1％Ponceau S（上段）で染色することによって検出され、一方カタラーゼは、カタラーゼに特異的な抗体（Calbiochem;rabbit polyclonal219010;1:5,000希釈）で免疫染色することによって検出された（15）。 カタラーゼはHSV-1ウイルスで検出されたが、Had2、VSV、またはHSV-1aカプシドでは検出されなかったことに注意してください。 パネルｃは、ショ糖密度勾配解析の結果を示す。 ５ ０μ ｌのｔｎｅ中の精製Ｈ ＳＶ−１の合計５ ０μ ｇを、ＴＮＥ中の２ ０％〜５ ０％スクロースの６ ０ ０μ ｌ勾配上で遠心分離した。 勾配を分画し、個々の画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、続いてポリビニリデン二フッ化（ＰＶＤＦ）上にブロッティングし、１％Ｐｏｎｃｅａｕ Ｓで染色した。 勾配（上の行）におけるウイルスの位置はカタラーゼ（下の行）の位置と一致し、二つが関連していることを示唆していることに注意してください。

精製されたビリオンをプロナーゼ（レーン1-3）およびトリトンX-100（a、レーン4および5）で処理し、プロナーゼおよびトリプシン処理（b、レーン1-3）によるhsv-1のカタラーゼの局在化。 パネルａは、無傷のＨＳＶ−１（レーン３および４）およびプロナーゼ（レーン１および２）およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１ ０ ０（レーン５）での処理後のビリオン中に存在するタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよ カタラーゼは無傷のビリオン（レーン3および4）およびプロナーゼ処理ビリオン（レーン1および2）に存在するが、1％トリトンX-100（レーン5）で処理した後のビリオンには存在しないことが判明したことに注意してください。 ２ ５ｍｇ／ｍｌ）を１ｍｇ／ｍｌのプロナーゼ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ５ ３ ７ ０ ８ ８）で４時間３ ７℃で消化することによりプロナーゼ処理を行った。 Triton X-100処理は、10mMジチオトレイトール（DTT）を含むTNE緩衝液中で精製されたウイルスを1％Triton X-100に調整し、氷上（4℃）で15分間インキュベートすることによって行 次いで、得られたカプシドを、ｓｄｓ−ＰＡＧＥおよびＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析の前に、ショ糖勾配遠心分離によって精製した。 （ｂ）プロナーゼまたはトリプシンによるｉｎ ｖｉｔｒｏ処理後の精製Ｈ ＳＶ−１のウェスタンブロット分析。 精製されたＨＳＶ−１（１ｍｇ／ｍｌ）の合計１ ０ ０μ ｌを２ｍｇ／ｍｌプロナーゼまたは２ｍｇ／ｍｌトリプシンに調整した。 対照インキュベーションには酵素はなかった。 混合物を３ ７℃で２時間インキュベートし、ビリオンを２ ０％〜５ ０％のスクロース勾配で遠心分離することによって酵素から離れて精製した（図１の凡例に記載）。 1. ウイルス標本を遠心分離によりペレット化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析により調べた。 カタラーゼ（ウサギポリクローナル）のブロットを染色した。; ｇａｒｙ ＣｏｈｅｎおよびＲｏｓｅｌｙｎ Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇからの贈り物；１：５，０ ０ ０）。 プロテアーゼ処理は糖タンパク質Dの消化を引き起こしたが、カタラーゼではなく、カタラーゼがHSV-1膜の内側に位置していることを示していることに注意してください。カタラーゼの位置のためのより精密な定義は非イオンの洗剤Triton X-100（TX-100）の浄化されたウイルスの処置によって得られました。 新鮮なウイルスを用いて実施すると、この処理は、ウイルス膜、膜糖タンパク質、およびほぼすべての20以上の被検体タンパク質（UL36、UL37、およびUS3を除くすべて）の損失を引き起こす（13、21、27）。 しかし、カプシドはその完全性を保持し、主要なカプシドタンパク質のどれも失われない。 ウイルスDNAはカプシドの中に保持されます。 実験は、1％TX-100とhsv-1の処理とスクロース密度勾配遠心分離によって得られたカプシドの単離を関与していました。 その後、ウェスタンブロット分析を使用して、カタラーゼの存在についてカプシドを試験した。 その結果、ウイルス糖蛋白質および被包蛋白質は予想通り除去され、カタラーゼも同様に除去されたことが示された（図参照）。 ２ａ、レーン４および５）。 この実験は、カタラーゼがHSV-1被検体に存在することを示すと解釈される。

図に示すような情報。 2は、HSV-1ビリオンあたりのカタラーゼ分子の数を決定するために使用することができます(15). この測定は、精製されたウイルスの二つの同一のアリコートから始めて行われた。 二つは、（i）クーマシーブルーステインゲルからの主要なカプシドタンパク質分子（UL19）の数と（ii）校正されたウェスタンブロットから60-kDaカタラーゼ分子の数の決 代表的な決定では、この分析はUL19へのカタラーゼのモル比のための1:207.5の値をもたらした。 HSV-1カプシドあたり955UL19分子があるので、カプシドあたりのカタラーゼ分子の数は955/207.5または4.6であると決定された。 第二の同様の決定は7.1カタラーゼ分子の値をもたらした。 活性カタラーゼ分子（11、20）に四つの60kDaサブユニットがあるので、結果はビリオンあたり1-2カタラーゼ四量体の存在を示している。

HSV-1ビリオン内にカタラーゼが存在することは、H2O2による酸化的損傷からのウイルスの保護に関与している可能性を示唆している。 あるいは、カタラーゼは、被検体が宿主細胞の細胞質に添加され、いかなる保護機能も有さないので、HSV-1に受動的に組み込まれてもよい。 二つの可能性を区別するために、我々はH2O2in vitroによる不活性化に精製HSV-1の感度を調べた。 HSV-1は、カタラーゼ阻害剤アジドナトリウム（Nan3）の存在下または非存在下でH2O2で処理し、ウイルス力価は、（カタラーゼ阻害剤の非存在下で）その後決定した。 結果は、５ ０ｍ ＭのＨ２Ｏ２が力価の適度な減少（３〜４倍）を生じたが、Ｎａｎ３が存在する場合、１ ０ ６倍以上の致死効果が観察されたことを示した（表１）。 対照実験では、Ｎａｎ３単独によるＨＳＶ−１の死滅はほとんど示されなかった（表１）。 結果はカタラーゼがH2O2によってHSV-1の不活性化に対して保護の重要なレベルを提供することを示すために解釈されます。