Articles

PMC

by admin

TEKST

Virus opplever ganske forskjellige miljøer avhengig av om De replikerer inne i en vertscelle eller i transitt fra en vert til en annen. Innenfor en celle blir virus-og viruskomponentene utsatt for et reduserende miljø, hvor redokspotensialet bestemmes primært av glutation (18). I motsetning, utenfor en celle, er viruset utsatt for oksygen og giftige produkter avledet fra oksygen, som hydrogenperoksid, superoksid og hydroksylradikale, reaktive arter som har potensial til å inaktivere viruset. For å takle slike svært reaktive forbindelser uttrykker planter og dyr enzymer som kan konvertere dem til ikke-toksiske produkter. Eksempler på slike enzymer er katalase, peroksidaser og superoksiddismutase (28). Her beskriver vi resultatene av studier som viser tilstedeværelsen av katalase inne i det rensede herpes simplex virion. Tester ble deretter utført for å avgjøre om intern katalase kunne beskytte viruset mot inaktivering AV H2O2.Studier av katalase ble utført med herpes simplex virus 1 (HSV-1) som ble dyrket På Vero-celler i kultur og renset ved sukrose tetthet gradient sentrifugering. Når virussuspensjoner ble justert til 1% H2O2, begynte oksygenbobler å danne seg raskt, noe som indikerer tilstedeværelsen av katalase(Fig . 1a, venstre rør). Bobler ble tydelig visuelt etter noen få sekunder med inkubasjon ved romtemperatur og fortsatte å danne og forstørre i minst 20 min. Det ble imidlertid ikke dannet bobler hvis katalasehemmeren natriumazid ble tilsatt til virussuspensjonen før H2O2-behandling (Fig. 1a, høyre). Analysene var også negative når (i) viruset ble fjernet fra oppløsningen ved sentrifugering før tilsetning AV H2O2 eller (ii) HSV-1 kapsider (B kapsider) ble erstattet av intakt virus. I lignende analyser ble det ikke observert bobler som indikerer tilstedeværelse av katalase med renset vesikulært stomatittvirus eller humant adenovirus 2(data ikke vist). Western blot analyse bekreftet tilstedeværelsen av katalase assosiert MED HSV-1 virus, men ikke med adenovirus, vesikulært stomatitt virus (VSV), ELLER HSV-1 a capsids (Fig. 1b).

en ekstern fil som inneholder et bilde, illustrasjon, etc. Objektnavnet er zjv9990967360001.identifikasjon AV HSV-1-assosiert katalase ved enzymanalyse (a), Western blot analyse (b) og sukrose tetthet gradient sentrifugering (c). Panel a viser et rør som inneholder renset HSV-1 20 min etter at oppløsningen ble justert til 1% H2O2 (venstre rør) og en lignende inkubasjon som en katalasehemmer (2 mM natriumazid) ble tilsatt før H2O2 (høyre). Legg merke til dannelsen av bobler i venstre rør, som indikerer tilstedeværelsen av katalase i viruset. Viruskonsentrasjonen var 0,25 mg / ml I TNE (0,01 M Tris-HCl, 0,5 M NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,5), og inkubasjon var ved romtemperatur. VIRUSET var KOS-stammen AV HSV-1, som ble dyrket på monolagskulturer Av Vero-celler og renset ved sukrose tetthetsgradientsentrifugering, og titeren ble bestemt ved endepunktfortynning som tidligere beskrevet (14). Panel b viser Resultatene Av En Western blot test for tilstedeværelse av katalase I HSV-1, humant adenovirus 2 (HAd2), vesikulært stomatitt virus (VSV), OG HSV-1 a capsids. Humant adenovirus 2 og vesikulært stomatitt virus (Indiana; San Juan stamme) ble dyrket på monolagskulturer av Henholdsvis HeLa og Vero-celler og renset ved tidligere beskrevne prosedyrer (12, 17). Publiserte metoder ble også brukt for rensing AV HSV-1 a OG B capsids (23). Store kapsidproteiner ble påvist ved å fargelegge blottet med 1% Ponceau S (øvre rad), mens katalase ble påvist ved immunostaining med antistoff spesifikt for katalase (Calbiochem; rabbit polyclonal 219010; 1:5,000 fortynning) (15). Merk at katalase ble påvist I HSV-1 virus, men Ikke HAd2, VSV, ELLER HSV-1 a capsids. Panel c viser resultatene av sukrose tetthet gradient analyse. Totalt 50 µ renset HSV-1 av 50 µ tne ble sentrifugert på en 600-µ gradient på 20% til 50% sukrose i TNE. Sentrifugering var i 45 min ved 22.000 rpm i En Beckman SW55 rotor ved 4°C. gradienten ble fraksjonert, og individuelle fraksjoner ble analysert VED SDS-SIDE etterfulgt av blotting på polyvinylidendifluorid (PVDF) og farging med 1% Ponceau S. blottet ble deretter utvunnet og farget med antistoff spesifikt for katalase (som migrerte sammen med standard katalase; Worthington LS001872). Merk at plasseringen av viruset i gradienten (øverste rad) sammenfaller med katalase (nederste rad), noe som tyder på at de to er tilknyttet.

Kontrollforsøk ble utført for å bekrefte at katalase var assosiert MED HSV-1 og ikke med urenheter tilstede i viruspreparatet. Renset HSV-1 ble sentrifugert inn i et bånd på en sukrose tetthet gradient, gradienten ble fraksjonert, Og Western blot analyse ble brukt til å teste individuelle gradient fraksjoner for tilstedeværelse av katalase. Resultatene viste at katalase var tilstede i virusholdige fraksjoner, men ikke i flankerende (Fig. 1c). Resultatene tolkes for å indikere at katalase er assosiert MED HSV-1 og ikke med forurensninger, som katalaseholdige bakterier eller vertscellematerialer i viruspreparatet. SIDEN HSV – 1-genomet ikke koder for katalase (22), må det virusassosierte enzymet avledes fra vertscellen. Tidlige studier av vacciniavirus viste tilstedeværelse av katalase inne i den modne virionen (8). Bortsett fra denne observasjonen vet vi ikke om noen annen rapport av katalase som en komponent i en virusstruktur.

Videre analyse AV HSV-1-assosiert katalase var rettet mot å bestemme plasseringen av enzymet i virionen. To typer eksperimenter ble gjort. Først ble renset virus behandlet med det proteolytiske enzymet pronase for å nedbryte virusglykoproteinene og eventuelle proteiner som ikke var inneholdt i virionmembranen. Interne virale proteiner ble forventet å være upåvirket, da pronase ikke krysser virus lipid dobbeltlag (16). Etter pronasebehandling ble viruset høstet ved sentrifugering, og omfanget av katalasetap ble bestemt Ved Western blot-analyse. Resultatene viste ingen tegn på katalasetap i to konsentrasjoner av virustestet (se katalasebåndet I Fig. 2a, baner 1 og 2). Interne kontroller viste at virusoverflaten glykoproteiner gB og gH ble spaltet som forventet(Fig. 2a; sammenlign baner 2 og 3). På Samme måte viste Western blot-analyse at hsv-1 glykoprotein D ble fordøyd av pronase eller trypsin under forhold der katalase ikke ble påvirket (Fig. 2b). Renset katalase i oppløsning ble også fordøyd under de samme forhold. I kontrast, ingen nedbrytning av interne tegument (UL47, UL48 OG UL49) eller kapsidproteiner (UL19, UL38, UL18; Fig. 2a, lanes 1 og 2) ble observert. Resultatene tolkes for å indikere at katalase er plassert inne I hsv-1-konvolutten.

en ekstern fil som inneholder et bilde, illustrasjon, etc. Objektnavnet er zjv9990967360002.Lokalisering av katalase I HSV-1 Ved behandling av rensede virioner med pronase (baner 1 til 3) Og Triton X-100 (a, baner 4 og 5) og ved pronase - og trypsinbehandling (b, baner 1 til 3). Panel a viser SDS-SIDE-og Western blot-analyse av proteiner til stede i intakt HSV-1 (felt 3 og 4) og i virioner etter behandling med pronase (felt 1 og 2) Og Triton X-100 (felt 5). Merk at katalase ble funnet å være tilstede i intakte virioner (felt 3 og 4) og i pronasebehandlede virioner (felt 1 og 2), men ikke i virioner etter behandling med 1% Triton X-100 (felt 5). Pronasebehandling ble utført ved å fordøye renset HSV-1 (0,25 mg / ml) med 1 mg/ml pronase (Streptomyces griseus; Calbiochem 537088) i 4 timer ved 37°C. etter pronasebehandling ble viruset reisolert ved sukrose tetthetsgradient sentrifugering før sds-PAGE og Western blot analyse. Triton X-100-behandling ble utført ved å justere renset virus til 1% Triton X-100 i TNE-buffer inneholdende 10 mM dithiothreitol (DTT) og inkubere i 15 min på is(4°C). De resulterende kapsidene ble deretter renset ved sukrose gradient sentrifugering før sds-PAGE og Western blot analyse. (B) Western blot analyse av renset HSV-1 etter behandling in vitro med pronase eller trypsin. Totalt 100 µ renset HSV-1 (1 mg/ml) ble justert til 2 mg/ml pronase eller 2 mg/ml trypsin. En kontroll inkubasjon hadde ingen enzym. Blandinger ble inkubert i 2 timer ved 37°C, og virioner ble renset bort fra enzymer ved sentrifugering på en 20% til 50% sukrose gradient som beskrevet i legenden Til Fig. 1. Virusprøver ble pelletert ved sentrifugering og undersøkt ved sds-PAGE og Western blot analyse. Blots ble farget for katalase (kanin polyclonal; se ovenfor) og glykoprotein D (mus monoklonalt antistoff DL11; en gave Fra Gary Cohen Og Roselyn Eisenberg; 1: 5000). Merk at proteasebehandling forårsaket fordøyelse av glykoprotein D, men ikke katalase, noe som indikerer at katalase er plassert inne I hsv-1-membranen.En mer presis definisjon for plasseringen av katalase ble oppnådd ved behandling av renset virus med det ikke-ioniske vaskemiddelet Triton X-100 (TX-100). Når det utføres med friskt virus, forårsaker denne behandlingen tap av virusmembranen, membranglykoproteinene og nesten alle de 20 eller flere tegumentproteinene (ALLE UNNTATT UL36, UL37 OG US3) (13, 21, 27). Kapsidet beholder imidlertid sin integritet, og ingen av de store kapsidproteinene går tapt. Viruset DNA er beholdt inne i kapsid. Eksperimenter involvert behandling AV HSV-1 med 1% TX-100 og isolering av de resulterende capsids av sukrose tetthet gradient sentrifugering. Western blot analyse ble deretter brukt til å teste capsids for tilstedeværelse av katalase. Resultatene viste at virusglykoproteiner og tegumentproteiner ble fjernet som forventet, og at katalase også ble fjernet (Se Fig. 2a, baner 4 og 5). Dette eksperimentet tolkes for å indikere at katalase er tilstede I HSV-1 tegument.

Informasjon som vist I Fig. 2 kan brukes til å bestemme antall katalasemolekyler per HSV – 1 virion (15). Denne måling ble utført som begynner med to identiske alikvoter av renset virus. De to ble brukt til bestemmelse av (i) antall store kapsidproteinmolekyler (UL19) fra En Coomassie blåfarget gel og (ii) antall 60-kDa katalase molekyler fra en kalibrert Western blot. I en representativ bestemmelse ga denne analysen en verdi på 1: 207,5 for molforholdet katalase TIL UL19. Siden det er 955 UL19 molekyler per HSV – 1 kapsid, ble antall katalasemolekyler per kapsid bestemt til å være 955 / 207.5 eller 4.6. En annen lignende bestemmelse ga en verdi på 7,1 katalasemolekyler. Siden det er fire 60-kDa-underenheter i et aktivt katalasemolekyl (11, 20), indikerer resultatene tilstedeværelsen av 1 til 2 katalasetetramere per virion.

tilstedeværelsen av katalase inne I hsv-1 virion antyder muligheten for at det kan være involvert i beskyttelse av viruset FRA oksidativ skade VED H2O2. Alternativt kan katalase passivt inkorporeres I HSV-1 da tegumentet tilsettes i vertscellens cytoplasma og ikke har noen beskyttende funksjon. For å skille mellom de to mulighetene, undersøkte vi følsomheten av renset HSV-1 til inaktivering Av H2O2in vitro. HSV-1 ble behandlet MED H2O2 i nærvær eller fravær av katalaseinhibitoren natriumazid (NaN3), og virustiteren ble deretter bestemt (i fravær av katalaseinhibitor). Resultatene viste at mens 50 mM H2O2 ga en beskjeden reduksjon i titer (3 til 4 ganger), ble det observert en dødelig effekt på 106 ganger eller større Hvis NaN3 var tilstede (Tabell 1). Kontrollforsøk viste lite drap AV HSV – 1 Ved NaN3 alene (Tabell 1). Resultatene tolkes for å indikere at katalase gir et betydelig beskyttelsesnivå mot inaktivering AV HSV – 1 VED H2O2.

Tabell 1

virustiter etter behandling MED H2O2 med eller uten katalasehemmer (NaN3)a

behandling titer
tid i 10 mm h2o2 tid i 50 mm h2o2
ingen 2 h 20 h ingen 2 h 20 t
Ingen NaN3 28 × 1010 60 × 1010 8 × 1010 28 × 1010 10 × 1010 8 × 1010
2 Mm NaN3 30 × 1010 6 × 1010 <104 30 × 1010 1 × 1010 <104
PUR HSV-1 (200 µ; 0,25 mg/ml i tne) ble inkubert ved romtemperatur for de angitte tider med h2o2 i nærvær eller fravær av 2 mm nan3, en katalasehemmer. Virustiteren ble deretter bestemt På Vero-celler (14) i fravær AV H2O2 Og NaN3.

det forventes ikke AT HSV – 1 må beskyttes MOT oksidativ skade AV H2O2 mens DEN er forbundet med en vertscelle. Som beskrevet ovenfor finnes et reduserende miljø i cellen, og det vil forhindre dannelse AV H2O2. Utenfor vertscellen er miljøet imidlertid en oksiderende, som er i stand TIL å produsere H2O2 både inne i viruset og i det omkringliggende medium. HSV-1 vil møte dette miljøet som det overføres fra en vert til en annen, og katalase kan være involvert i beskyttelse AV HSV-1 smittsomhet under transitt. HSV-1-assosiert katalase kan også gi beskyttelse MOT H2O2 produsert av kommensale bakterier eller andre kilder. H2O2 produsert av laktobaciller har for eksempel vist seg å beskytte det kvinnelige kjønnsorganet mot sykdom på grunn av mikrobiell infeksjon (4). På grunn av sin høye katalytiske hastighet kan virusassosiert katalase ha en rolle i beskyttelse AV HSV-1 til tross for det lave kopieringsnummeret (1 til 2 kopier per virion). Leverkatalase, for eksempel, er i stand til å avgifte titalls millioner h2o2 molekyler per sekund, blant de høyeste katalytiske prisene rapportert for noe enzym (2).

alle virus i herpesfamilien har et tegument, et lag av protein som ligger mellom virus kapsidet og membranen (5, 6, 9, 13). HSV-1 tegument er 40 til 50 nm i tykkelse og består av ca 20 forskjellige protein arter, nesten alle som er kodet i virus genomet. Tegumentproteiner varierer vesentlig i deres overflod i virionen med 800 kopier eller mer AV de store artene, SOM UL47, UL48 og UL49 (Se Fig. 2a, kjørefelt 3) (5, 16). Mange tegumentproteiner er involvert i tidlige trinn AV hsv-1-replikasjon, for eksempel aktivering av tidlig gentranskripsjon og demping av vertscelleproteinsyntese (13, 24, 25). Tegumentet er samlet inn I den nasende HSV-1-virionen som EN DNA-inneholdende kapsidknopper i en vesikkel av trans-Golgi-nettverket (10). Det foreslås at katalase inkorporeres sammen med andre tegumentproteiner under den spirende prosessen.

i uinfiserte celler er mest katalase funnet sekvestrert i peroksisomer (26). For at det skal inkorporeres i avkom HSV-1 under tegumentasjon som beskrevet ovenfor, må katalase frigjøres fra peroksisomer. Vi foreslår at dette kan skje som en konsekvens av storskala omorganisering av cytoplasmatiske membraner som følger MED hsv-1 replikasjon (1).

Palamara et al. (19) har vist at en reduksjon i cytoplasmatisk glutationkonsentrasjon oppstår umiddelbart Etter At Vero-celler er infisert MED HSV-1. En reduksjon i glutationkonsentrasjonen forventes å forårsake en reduksjon i det cytosoliske reduksjonspotensialet, og denne reduksjonen ser ut til å potensere hsv-1-replikasjon. Ekstra glutation gitt i vekstmediet ble funnet å motvirke HSV-1 vekst (19). Som eksternt tilsatt glutation, kan cytosolisk katalase øke reduksjonspotensialet til cytoplasma ved å fjerne H2O2. Det foreslås derfor at en konsekvens av katalaseinkorporering i avkomvirioner kan være å potensere virusvekst ved å frata infiserte celler av katalase.

det lille antallet katalasemolekyler per virion kan forklare hvorfor det ikke ble påvist i en massespektrometrisk analyse av hele HSV-1-virioner (7). DET er flere høy-kopi-nummer HSV-1 virion proteiner som kan skjule signal fra katalase (for eksempel er det tusenvis av kopier av glykoproteinmolekyler og 955 kopier av det store kapsidproteinet ). Overfloden av katalase oppfyller ikke den uformelle standarden for deteksjon ved massespektrometri(synlighet på En Coomassie-farget sds-SIDE gel). Peroksiredoksin, et peroksisomalt protein med antioksidantaktivitet, ble påvist i massespektrometrisk analyse AV HSV-1 (7, 26).

i fremtiden kan det være mulig å utnytte følsomheten TIL HSV-1 til de cytotoksiske effektene AV H2O2. Det forventes at viruset vil være spesielt sårbart når det er i et oksidasjonsmiljø utenfor vertscellen og når katalase er hemmet.