degeneratie van de tussenwervelschijf is een veel voorkomende aandoening met een complexe multifactoriële etiologie. 1 laaggradige infectie is voorgesteld als een oorzaak van disc degeneratie met Propionibacterium acne geïdentificeerd bij 84% van de patiënten met hernia en ischias met behulp van serologie en culturen. 2 moleculaire veranderingen zijn ook waargenomen, zoals de verhoogde productie van katabole enzymen (cathepsine, lysozym en verschillende matrixmetalloproteïnasen) en ontstekingscytokines. 3 jonge patiënten met herniatie van de lumbale schijf vertoonden een slechter herstel na een operatie wanneer ze preoperatief verhoogde serumconcentraties van hooggevoelige c-Reactieve proteïne (hs-CRP) hadden vertoond. Het is echter niet duidelijk of hoge niveaus van CRP en ontstekingscytokines wijzen op een lokale infectie of een ontstekingsreactie op hernia. 4

pathogenen zoals Parvo virus B19 of Epstein Barr Virus (EBV) spelen een belangrijke rol in de pathogenese van verschillende vormen van artritis. 5,6 herpesvirussen zijn een diverse familie van grote DNA-virussen, die allemaal levenslange latente infecties kunnen vaststellen. Primaire infectie met veel van deze virussen komt vaak voor tijdens de kindertijd. 7,8

deze studie had tot doel de mogelijke rol te onderzoeken van herpesvirussen, Herpes Simplex Virus type-1(HSV-1), Herpes Simplex Virus type-2 (HSV-2) en Cytomegalovirus (CMV) bij de pathogenese van degeneratie van de tussenwervelschijf. Een moleculaire analyse van tussenwervelschijf specimens verkregen tijdens discectomie toonde een aanzienlijke frequentie van CMV en HSV-1 DNA in gedegenereerde schijven, wat suggereert dat virale infecties een belangrijke factor in de etiologie van deze ziekte zou kunnen zijn.

patiënten en methoden

in totaal werden 16 opeenvolgende patiënten onderzocht die binnen zes maanden na hernia lumbale schijf een discectomie ondergingen. Er waren acht mannen en acht vrouwen met een gemiddelde leeftijd van 40,38 jaar (17 tot 65). De studie had ethische goedkeuring. De diagnose van hernia lumbale schijf werd vastgesteld door lichamelijk onderzoek en MRI. Om een controlegroep te vormen, werden schijven percutaan genomen van twee patiënten met thoracolumbale burstfracturen die een operatie ondergingen. Deze patiënten ondergingen ook preoperatief MRI-onderzoek om gelijktijdige degeneratie uit te sluiten. De aard van de in dit onderzoek geteste monsters stond om ethische redenen niet toe dat meer tussenwervelschijven van gezonde individuen werden opgenomen, terwijl het alternatief van kadaverachtige specimens als controlegroep werd opgegeven omdat de meerderheid van de volwassen populatie een voorgeschiedenis heeft van lage rugpijn en degeneratie van de schijf.

naast het materiaal van de hernia verkregen tijdens de discectomie werd van elke patiënt een perifeer bloedmonster genomen. Weefselmonsters werden in gesteriliseerd polypropyleen 1 geplaatst.5 ml tubes en opgeslagen bij -80°C, totdat DNA / RNA-extractie en polymerasekettingreactie/ kwantitatieve polymerasekettingreactie (PCR/qRT-PCR) werden uitgevoerd. De detectie van HSV-1-en CMV -, IgM+ – en IgG+ – antilichamen uit het plasma werd uitgevoerd met behulp van een standaard enzymimmunoassay.

DNA / RNA-extractie.

genomisch DNA en totaal RNA werden geëxtraheerd uit de weefselmonsters met behulp van de NucleoSpin Weefsel XS kit en NucleoSpin RNA XS kit (Macherey-Nagel GmbH en Co., Düren, Duitsland), respectievelijk volgens de instructies van de fabrikant. Gezuiverd RNA werd verder behandeld met DNaseI om om het even welke besmetting van DNA te vermijden. DNA – en RNA-monsterconcentraties werden bepaald met behulp van een spectrofotometer (260 nm) voorafgaand aan PCR-amplificatie of qRT-PCR.

detectie van herpesvirussen DNA.

we hebben acht verschillende herpesvirussen getest (HSV-1/-2, Varicella-zostervirus (VZV), EBV, CMV, Humane herpesvirussen 6, 7 en 8 (HHV6, HHV7 en HHV8)) met behulp van RhyMA Test-Herpes Screening volgens de instructies van de fabrikant (Euroclone, Pavia, Italië). De rhyma-test was gebaseerd op de Reverse Hybridisation-technologie met multiplex DNA-amplificatie door PCR met specifieke biotinyleerde primers, gevolgd door de hybridisatie van de geamplificeerde en biotinyleerde DNA-fragmenten met strips op sondes, specifiek voor elk van het herpesvirus. Voor de evaluatie van de resultaten was een laatste zich ontwikkelende reactie vereist met behulp van een biotine-streptavidine-systeem. Positieve en versterkingscontroles werden ook opgenomen in elke strip. Voor de interpretatie van de resultaten werd de ontwikkelde strook van elk monster afgestemd op een standaardtabel. De Rhyma Test-Herpes Screening is gecertificeerd voor gebruik in vitro diagnostisch, certificeren van de hoge specificiteit en gevoeligheid van de assay. Om de met de Rhyma Test-Herpes screening assay verkregen resultaten te verifiëren, werden de PCR-producten ook uitgevoerd in een laagsmeltende agarose gel van 3% die het verwachte elektroforetische patroon voor elk virus produceerde. Tot slot werden de PCR-positieve monsters onderworpen aan directe sequencing analyse, bevestiging van de resultaten verkregen met behulp van de RhyMA Test-Herpes screening assay.

HSV-1 en CMV qRT-PCR.

totaal RNA werd reverse transcripted met behulp van de retro-script kit (Ambion Inc., Austin, Texas, USA) met willekeurige hexamer primers. cDNA ’s werden getest op template kwaliteit door standaardcurven te construeren met behulp van seriële verdunningen van elke cDNA als templates in qRT-PCR’ s. De cDNA-templates gaven een assay-efficiëntie van 90% tot 105%, en de R2 van alle standaardcurves was > 0,98. Na omgekeerde transcriptie werden cDNAs versterkt met ICP0-en IE1-specifieke primers voor de kwantificering van respectievelijk HSV-1 en HCMV mRNAs, zoals eerder beschreven. 9,10

alle qRT-PCR ‘ s werden uitgevoerd in drievoud met Maxima SYBR Green qPCR master mix (Fermentas Inc., Glen Burnie, Maryland) in een ABI PRISM 7500 Sequentiedetector (PE Biosystems, Foster City, Canada), inclusief de geëxtraheerde RNA-monsters en positieve en negatieve controles. SYBR groene fluorescentie werd gemeten in de loop van 40 versterkingscycli. Voor elke gekwantificeerde template werd het gemiddelde cyclusaantal berekend waarbij de productaccumulatie Het lineaire bereik (CT) binnenging. Herhaalde CT-waarden lagen binnen 0,4 cycli van elkaar. De CT-waarde van 18SrRNA voor een bepaald sjabloon werd afgetrokken van de CT die werd verkregen voor elk mRNA van belang (ICP0 en IE1) van hetzelfde sjabloon om de genormaliseerde CT-waarde (ΔCT) voor elk sjabloon te verkrijgen.

tumornecrosefactor-α en interleukine-6 genexpressie.

voor de kwantificering van TNF-α Of IL-6 mRNA werd 1 µl cDNA gebruikt samen met de hierboven getoonde primers in een reactie van 20 µl, waarbij SYBR green werd gebruikt als marker voor DNA-inhoud. De gebruikte primers waren: beta actin: Forward: 5′-Tcagaagaactc CTA TGT GG-3′, Reverse: 5 ‘- TCT CTT TGA TGT CAC GCA CG-3′; TNF-a Forward: 5′-CAC GCT CTT CTG TCT ACT GAA CTT CG-3′, Reverse: 5′-GGC TGG GTA GAG AAT GGA TGA ACA CC-3’, 11 IL-6: Forward: 5 ‘- ACA GCC ACT CAC CTC TTC AG -3’, Reverse: 5 ‘- GTG CCT CTT TGC TGC TTT CAC -3’. 12 Er waren geen bijproducten aanwezig in de reactie, zoals blijkt uit het dissociatiepatroon dat aan het einde van de reactie werd verstrekt en uit agarosegelelektroforese (gegevens niet getoond). De amplificatie-efficiëntie van de TNF-α en de IL-6 producten was dezelfde als die van beta actine zoals aangegeven door de standaard amplificatiecurven, waardoor we de formule konden gebruiken: vouwverhoging = 2 – (ΔCt A-ΔCtB). De reacties werden in drievoud uitgevoerd om statistische evaluatie mogelijk te maken.

resultaten

een PCR-reverse hybridisatietest werd gebruikt om het DNA van acht verschillende herpesvirussen te screenen in de tussenwervelschijf van patiënten met hernia (Fig. 1). Herpesvirus DNA werd ontdekt in 13 van de 16 specimens (81,25%). HSV-1 vertoonde de hoogste prevalentie bij negen patiënten (56,25%), terwijl CMV werd gedetecteerd bij zes patiënten (37,5%) (tabel I). Twee patiënten waren gelijktijdig geïnfecteerd met zowel HSV-1 als CMV. DNA van HSV-2, VZV, EBV, HHV6, HHV7 en HHV8 werd niet gedetecteerd in de schijfstalen van geen van de patiënten. Geen van de controlepatiënten (C1 en C2) testte positief voor de aanwezigheid van herpesvirus-DNA (Fig. 1).

de status van HSV-1-en CMV-infectie in de tussenwervelschijf werd onderzocht door de mogelijke expressie van virale transcripten met realtime qRT-PCR te onderzoeken. De genexpressie van het herpesvirus werd in geen van de geteste monsters gedetecteerd, wat de afwezigheid van een actieve virale infectie aantoont, waardoor de vestiging van latente herpesvirusinfectie in deze specimens wordt gesuggereerd.

De seropositiviteit van patiënten werd ook onderzocht. Alle HSV-1-of CMV-PCR-positieve patiënten vertoonden respectievelijk IgG + – antilichamen voor hetzelfde virus (tabel I). In drie gevallen voor HSV-1 en in zes gevallen voor CMV werden IgG+ – antilichamen gedetecteerd zonder gelijktijdige prevalentie van viraal DNA. Bovendien waren de HSV-1-en CMV IgM+ – antilichamen uit het perifere bloed bij alle patiënten negatief, wat erop wijst dat geen van de patiënten een acute herpesvirusinfectie had ervaren op het moment van chirurgische excisie.

naast de macroscopische indicatie van ontsteking rond de hernia, hebben we ook experimenteel bewijs van ontsteking verkregen in de tussenwervelschijf specimens door de mRNA-spiegels van TNF-α en IL-6 te onderzoeken, in alle monsters met behulp van qRT-PCR. De analyse toonde ongeveer twee – tot drievoudige toename van beide ontstekingsmerkers in de monsters in vergelijking met de controles (Fig. 2). Interessant is dat de patiënten die gelijktijdig met zowel HSV-1 als CMV geïnfecteerd waren, de hoogste concentraties TNF-α en IL-6 vertoonden. Bovendien vertoonden twee van de drie patiënten (patiënten 2 en 8) zonder bewijs van virale infectie lagere TNF-α-spiegels. Deze negatieve correlatie werd niet gevonden voor IL-6-spiegels bij deze patiënten.

discussie

deze studie suggereert het concept dat infectie met het herpesvirus degeneratie van de schijf kan bevorderen. We waren in staat om HSV-1 en CMV DNA te detecteren in een groot aantal menselijke tussenwervelschijf monsters verzameld tijdens discectomie.

eerdere low-grade infectie is gesuggereerd als een mogelijke oorzaak van disc degeneratie. 2,4 verschillende auteurs hebben de relatie benadrukt tussen modische type 1 signalen (verhoogde signaalintensiteit in T2-gewogen MR beelden en verminderde signaalintensiteit in T1-gewogen MR beelden en fibrovasculair weefsel in de eindplaten) en infectie. Als de patiënten geen ernstige rugpijn, temperatuur of een afwijkend bloedprofiel hebben, is het moeilijk onderscheid te maken tussen modische 1-veranderingen en laaggradige infectie. 13,14

het verband tussen virale infectie en apoptose is uitgebreid onderzocht, waarbij de mechanismen van apoptose-inductie door virussen werden verduidelijkt. Het is nu bekend dat Parvovirus B19 en in het bijzonder zijn NS-1-eiwit, een krachtig cytotoxisch effect heeft op de gastheercellen en apoptose veroorzaakt in de geïnfecteerde cellen. 17 virussen spelen een rol in de pathogenese van verschillende vormen van artritis. Stahl et al. 5 detecteerden viraal DNA van meerdere virussen in synoviaal weefsel van patiënten met vroege artritis. Een recente studie suggereerde dat de gevorderde stadia van artrose kan worden gerelateerd aan verhoogde ontsteking en schade aan gewrichtskraakbeen als gevolg van Parvovirus B19. In een andere studie werd voorgesteld dat humaan Parvovirus B19 betrokken is bij de initiatie en bestendiging van synovitis bij reumatoïde artritis, wat leidt tot gewrichtslaesies in de loop van overmatige synthese van ontstekingscytokines en proteolytische enzymen. 19

HSV-1 infecties zijn endemisch over de hele wereld. Meer dan 90% van de volwassenen heeft antilichamen tegen HSV-1 tegen het vijfde decennium. Herpesvirussen zijn alomtegenwoordige pathogenen bij kinderen, latent blijven na een actieve infectie. 20,21 tijdens de beginfase van de infectie vindt virale replicatie plaats in ganglia met overleving van sommige cellen die het virale genoom compatibel houden met de normale cellulaire functie. Dit fijne evenwicht tussen gastheercellen en het virus kan door diverse stimuli worden verstoord, die tot reactivering leiden.

in onze studie had geen van de patiënten een acute herpesinfectie ervaren. Dit was duidelijk zowel op serologisch niveau, toe te schrijven aan afwezigheid van IgM+ antilichamen van het perifere bloed, als op moleculair niveau toe te schrijven aan het gebrek aan virale mRNA afschriften van de schijfsteekproeven. Zo kan de hoge prevalentie van HSV-1-infectie in de kindertijd, evenals de retentie ervan in het zenuwstelsel, een bevredigende verklaring bieden voor de aanwezigheid van zowel HSV-1 als CMV in de tussenwervelschijf.

de vraag rijst hoe de virussen de tussenwervelschijfruimte binnendringen. Het is duidelijk dat grote vasculaire kanalen de eindplaten passeren tijdens het vroege leven van de foetus, die vervolgens afnemen met de geboorte en volledig verdwijnen op de leeftijd van vier tot zes jaar oud, waardoor de schijf een van de grootste avasculaire weefseltypen in het lichaam is. 23 men zou kunnen speculeren dat de aanwezigheid van viraal DNA in de tussenwervelschijf secundair is aan de migratie van macrofagen of andere cellen die viraal DNA in de schijf tijdens de kindertijd bevatten terwijl de omgeving van de schijf nog steeds rijk is aan bloedvaten. Andere mechanismen kunnen ook een rol spelen, omdat het bekend is dat het herpes simplex virus in neuronale axonen kan worden geactiveerd door ontstekingscytokines, zoals IL-1 en TNF-α 24,25 en door antidromale migratie de schijfruimte kan betrekken.

zo activeert de ontstoken of gewonde schijf, die een verscheidenheid aan pro-inflammatoire cytokines produceert, latente virussen. Deze mechanismen kunnen ook de aanwezigheid van DNA van twee of meer virussen in de schijfsteekproeven verklaren. Zelfs als de aanwezigheid van virussen een secundair fenomeen is, kan hun aanwezigheid bijdragen aan de pathogenese van degeneratie van de tussenwervelschijf, aangezien virale antigenen de verslechtering van de schijf verder verbeteren door activering van het inflammatoire milieu dat geactiveerde macrofagen en andere cellen vergemakkelijkt om weefselschade te veroorzaken.

in onze studie onthulde intra-operatieve beoordeling van het chirurgische veld macroscopisch bewijs van ontsteking rond de hernia. Het bewijs van de ontsteking in de disc specimens en de bijdrage van virale infectie aan de versterking van het ontstekingsproces kwam uit de analyse van de mRNA-niveaus van bekende genen, die geassocieerd zijn met ontsteking, zoals TNF-α en IL-6. Beide ontstekingsmarkers vertoonden ongeveer twee tot drie keer hogere waarden in de monsters van de patiënten in vergelijking met de controlegroep. Interessant is dat de monsters die gelijktijdig met zowel HSV-1 als CMV geïnfecteerd waren, de hoogste concentraties TNF-α en IL-6 vertoonden, wat wijst op een synergetisch effect van de virussen. Bovendien waren de concentraties TNF-α net zo laag als de controlegevallen bij de patiënten waarbij we geen viraal DNA konden detecteren.

een recent review artikel stelt dat disc degeneratie geen diagnose is, maar een uitdrukking van de toestand van de disc, die het resultaat is van verschillende factoren die individueel of collectief handelen. 1 in plaats van het resultaat te zijn van een enkel proces, kan degeneratie van de schijf een aantal mogelijke oorzaken hebben, waaronder mechanische, veroudering, genetische, systemische, toxische en/of infectie. De afwezigheid van virale detectie in al onze 16 patiënten is in overeenstemming met de multifactoriële oorzaak van schijfverzakking. Het is bekend dat genetische factoren abnormale componenten van de matrix 26-28 veroorzaken die de structuur en functie van de schijf in gevaar brengen en de gevoeligheid van het schijfweefsel voor mechanische belasting verhogen. 29 epidemiologische studies hebben aangetoond dat genetische factoren het risico op degeneratie verhogen, 30-35, maar ze zijn niet verantwoordelijk voor alle gevallen, 28,36 met variaties tussen verschillende etnische populaties 37 zodat grote multi-etnische populatie studies nodig zijn. 38

de aanwezigheid van virussen in de schijf kan een omgeving creëren waarin de schijf kwetsbaar is voor schade door mechanische belasting en trauma. Het is waarschijnlijk dat viraal DNA aanwezig zou zijn op tussenwervelschijven niveaus, maar de mechanische spanningen die worden gepostuleerd om bij te dragen aan de degeneratie vindt plaats op het lumbosacrale niveau waar de problemen veel gemeenschappelijker zijn. 1 laaggradige infectie, met of zonder genetische invloed, kan de gevoeligheid van de tussenwervelschijf verhogen voor omgevingsfactoren, die secundair de biologische gebeurtenissen aansturen die leiden tot degeneratie van de schijf. Misschien doet herpes DNA dienst als een factor die de structurele kenmerken van de matrijs in de schijf verandert door apoptosis en lokale ontstekingsreactie te moduleren, die voorstellen dat virale besmetting of reactivering met de ziekte wordt geassocieerd.

De ontdekking door Marshall en Warren 39 dat infectie met Helicobacter pylori verantwoordelijk was voor de ontwikkeling van maagzweren leidde tot een belangrijke verschuiving in het medisch begrip. De mogelijkheid dat een infectieus proces kan bijdragen aan disc degeneratie moet serieus worden overwogen.

wij denken dat dit de eerste studie is die de aanwezigheid van herpesvirussen in de tussenwervelschijf documenteert bij patiënten met hernia. Verdere studies zijn noodzakelijk om de onderliggende mechanismen te bepalen en de potentiële rol van herpesvirussen in de pathogenese van degeneratieve schijfziekte te ondersteunen.

geen voordelen in welke vorm dan ook zijn ontvangen of zullen worden ontvangen van een commerciële partij die direct of indirect verband houdt met het onderwerp van dit artikel.