kinetische analyse LINE WEAVER-BURK vergelijking DOUBLE reciproque PLOT of ENZYME KINETICS

8.3. Lineweaver –Burk vergelijking (Double reciproque plot) :

in 1934 maakten Lineweaver en Burk een eenvoudige wiskundige wijziging in de vergelijking van Michalies-Menten door een dubbele inverse van substraatconcentratie en reactiesnelheid uit te zetten.

Line weaver Burk plot wordt verkregen door de reciproque van beide zijden van de michalies–Menteris vergelijking (MME) te nemen.

In de line weaver Burk (LB) plot wordt de vergelijking van Michaelis Menten omgezet in rechte lijncurve.

het wordt gebruikt om de Vmax te schatten vanuit de positie van het intercept op de X-as.

• rechte lijn wordt gegeven door Y = MX + C, waarbij C het snijpunt van Y op X is en M De Helling.
• als de M-waarde toeneemt, neemt de helling toe.
• als de waarde van Vmax gelijk is aan constant dan is De Km-waarde hoog en als De Km-waarde constant is, neemt de Vmax-waarde af.

hierin wordt de hyperbolische kromme een rechte lijn en de absolute waarde van het X-intercept van de lijn is de affiniteit (1/Km) van het enzym voor het substraat. De Y-as is 1 / Vmax. De helling van de lijn is Km/Vmax. Opnieuw, oorspronkelijk werd dit subjectief gedaan. Het is de veel fijnere methode om de best passende parameters te vinden voor de niet-getransformeerde Michaelis-Menten relatie.

toepassing

Het lineweaver–Burk-perceel wordt gebruikt om De Km en Vmax te bepalen. Het y-snijpunt van zo ‘ n grafiek is gelijk aan de inverse van Vmax; het X-snijpunt van de grafiek vertegenwoordigt -1/Km. Het geeft een snelle, visuele indruk van de verschillende vormen van enzymremming.

8.4. Eadie–Hofstee Plot

Eadie–Hofstee diagram is een grafische weergave van het enzym kinetiek in die reactie tarief is uitgezet als functie van de verhouding tussen het tarief en de substraat concentratie:

In dit Michaelis Menten vergelijking is weergegeven als

Omkeren en vermenigvuldigen met Vmax :

toepassing van Eadie–Hofstee Plot

snelle identificatie van Km en Vmax

8.5. Hanes Woolf Plot

grafische weergave van de verhouding tussen de initiële substraatconcentratie en de reactiesnelheid V wordt uitgezet tegen de substraatconcentratie .

Michaelis-Menten vergelijking wordt afgeleid als

omkeren en vermenigvuldigen met :

Rearrange :

This equation will give straight line of slope a Y-intercept of and an X-intercept of –km

Application :-

Used for determination of Km, Vmax and Vmax/Km parameters

8.6. Enzymremming

enzymen zijn eiwitten die als katalysator voor de reacties werken. Maar er activiteit wordt geremd of geblokkeerd door de moleculen die chemische stoffen (organisch / anorganisch) in de natuur. Deze moleculen of samenstellingen worden inhibitors genoemd en het proces waardoor zij het enzym inactiveren of zijn activiteit blokkeren wordt genoemd enzym remming.

ze remmen de enzymkatalytische activiteit reversibel of irreversibel door de aminozuurzijketens te wijzigen die nodig zijn voor de enzymatische activiteit.

bij het ontdekken van geneesmiddelen zijn geneesmiddelenanalogen ontworpen voor detoxificatie van veel antitoxinen omdat ze een remmende werking hebben.

8.6.1. Regels gevolgd door enzymremmingsreacties

1. enzym bindt met substraat in 1 : 1 verhouding op actieve plaats in een vergrendelde opstelling of geïnduceerde pasvorm.
2. Inhibitor verbindingen concurreren met substraat voor allosterische katalytische site op first come first basis om enzym inhibitor substraat complex of enzym inhibitor complexen te maken.
3. enzym en substraat of remmers reageren met elkaar op een kinetische manier die wordt uitgedrukt als kinetische constanten van een katalytische reactie.
4. fysiologische condities zoals pH, temperatuur, concentratie van substraat of reactanten bepalen de snelheid van enzymatische reacties.
5. intermoleculaire vormen tussen enzymsubeenheden, interacties tussen substraten of inhibitoren in de actieve groep, fysische eigenschappen van bindende aard: elektrofiele, hydrofiele, nucleofiele en metalloprotien aard; waterstofbinding beïnvloedt de totale enzymreactiesnelheden en de remmingswijze.

8.6.2. Typen Inreversibele enzymremming

8.6.2.1. Competitieve remming (reversibel): in dit, competitie aanwezig tussen inhibitor en het substraat voor de actieve plaats.

de katalytische plaats van het enzym wordt ingenomen door inhibitoren en de activiteit ervan wordt geremd. Maar de remming is omkeerbaar. In dit geval worden zowel enzymsubstraat als enzyminhibitor complex gevormd.

Effect op affiniteit :- wanneer de concentratie van remmers toeneemt, neemt de affiniteit toe, maar neemt de affiniteit van substraat af en neemt de Km-waarde toe. Maar wanneer de substraatconcentratie toen toeneemt zijn affiniteit stijgt en affiniteit van inhibitor daalt en Km-waarde daalt, d.w.z.,

de inhibitor bindt zich aan actieve plaatsen van een enzymen, wat betekent dat de inhibitor concurreert met substraat voor binding op actieve plaats, vandaar dat de affiniteit van substraat voor enzym afneemt en Km-waarde toeneemt. De nieuwe km wordt gegeven door Km, waar

waar

I = concentratie van remmer

Kdi = dissociatieconstante van remmer.

wanneer de inhibitorconcentratie toeneemt, neemt de km-waarde toe naarmate de affiniteit van het substraat afneemt. Als de dissociatieconstante van meer is, enzymremmer complex Meer, is a minder dus is km Minder. De waarde van a is gelijk aan 1 of groter dan 1. De nieuwe waarde van Km is aKm

Effect op Vmax

Vmax wordt berekend bij oneindige substraatconcentratie.

Vmax = Kcat

bij oneindige substraat concentratie zijn alle enzymen in de vorm van enzymsubstraat complex i.e. Vmax is not affected.

Lineweaver Burk plot of competitive inhibition

8.6.2.2. Examples of Competitive Inhibitors

(a) Allopurinol :

Drug used for treatment of gout. Uric acid is formed in the body by oxidation of hypoxanthine by the enzyme xanthine oxidase. Allopurinol is structurally similar to hypoxanthine and inhibits the enzyme xanthine oxidase and reduced uric acid formation.

(B) methotrexaat:

It is a competitive inhibitor of dihydrofolate reductase (DHFR). Dit medicijn wordt gebruikt voor kankertherapie. Het is structureel gelijkaardig aan foliumzuur dus, remt folaatreductase competitief. Het voorkomt de vorming van tetra-hydrofolaat. Vandaar, wordt de synthese van DNA geleden.

(c) MAO-remmers (Mono-Amine-Oxidase) :

zij zijn de eerste klasse antidepressiva die ontwikkeld moeten worden. MAO-remmers verhogen het niveau van serotonine dopamine door de MAO te remmen. bijvoorbeeld. Catecholamines (epinefrine en norepinefrines).

(d) Dicumarol :

dit geneesmiddel is vergelijkbaar met vitamine K. geneesmiddel warfarine werkt als een antistollingsmiddel door competitief vitamine K. te remmen

8.6.3. Niet-competitieve remming

er is geen competitie tussen inhibitor en het substraat aangezien de plaatsen van bijlagen van het substraat en de remmer verschillend zijn. Inhibitor heeft geen structurele gelijkenis met substraat daarom kan binden aan vrij enzym. Inhibitors binden zich met een enzymsubstraatcomplex dat de bindingsplaats van de remmer blootlegt. De band van inhibitor kan vervorming van de actieve plaats of allosteric plaats veroorzaken die de katalyse inactiveert.

Effect op affiniteit :

hoge affiniteit van inhibitor betekent lage dissociatie van enzymsubstraat complex tot enzymsubstraat. Hierin bindt de inhibitor aan andere dan actieve plaats op complex enzymsubstraat. Dat betekent dat de inhibitor affiniteit voor Es complex eerder dan enzym tonen. Aldus in aanwezigheid van inhibitor neemt de affiniteit van enzym naar substraat toe. Deze daling van De Km. Daarom wordt

Effect op Vmax

Vmax berekend bij oneindige substraatconcentratie. Bij oneindige substraat concentratie zijn alle enzymen in de vorm van enzymen substraat complex. De inhibitor toont affiniteit voor enzymen substraat complex. Aldus bindt de inhibitor aan Complex enzymensubstraat en verhindert de katalyse van complex enzymsubstraat in enzym en product. That’s why Vmax decreases and new Vmax is given by

Inhibitor concentration increases a value increases and Vmax decreases

On putting the values of new Km and new Vmax in lineweaver burk plot, The equation is as follows :-

Uncompetitive inhibitor causes different intercepts on both Y and X-axis but same slope.

8.6.4. Gemengde (niet-competitieve) remming

deze remmer lijkt niet structureel op het substraat, maar kan zich zowel aan het vrije enzym als aan het enzym substate complex binden.

wanneer de remmer zich van de actieve plaatsen aan het enzym bindt. Het veroorzaakt de conformational veranderingen en vermindert zijn katalytische activiteit. Aldus, enzym inhibitor en enzym substraat inhibitor complexen worden niet productief. De substraatconcentratie keert de reactie niet om. Vandaar, remming leidt tot ongewijzigde Km maar verminderde Vmax.

Lineweaver Burk plot wordt gebruikt om Km en Vmax in enzymkinetiek te bepalen. De y-intercept van een dergelijke grafiek is gelijk aan de inverse van Vmax, x-intercept van de grafiek vertegenwoordigt concurrerende inhibitors vandaar dezelfde y-intercepts (aangezien Vmax niet wordt beïnvloed door concurrerende inhibitors) maar er zijn verschillende slops.

niet-competitieve inhibitor produceert plot met dezelfde x-intercept als Km wordt niet beïnvloed, maar verschillende hellingen met y-intercept.

8.7. Kinetiek van Multisubstrate-reactie

in de enzymkinetiek houden eenvoudige reacties in dat één substraat aan een enzym bindt en katalytische reacties ondergaat. Deze aandoening is niet gebruikelijk. Een meerderheid van biochemische reacties gekatalyseerd door twee of meer substraten die deelnemen aan de reacties. Een enzym E bijvoorbeeld katalyseerde de reactie waarbij twee substraten A en B betrokken waren en leverde het product P en Q.

dit type reactie wordt Bi-substraat reactie genoemd . Deze reactie kan op twee manieren verlopen:

8.7.1. Sequentieel

zowel de substraten A als B binden zich aan enzym E, waarna de reacties de producten P en Q

dit type reactie wordt sequentiële of eenvoudige verplaatsingsreacties genoemd die verder worden onderverdeeld in volgende groepen.

geordende substraatbinding of geordend sequentieel mechanisme – in dit type moet één substraat binden voor een tweede substraat.

deze reactie geeft zowel de sequentiële binding van substraten als de sequentiële afgifte van het product aan. Dit type mechanisme wordt waargenomen in de reacties gekatalyseerd door lactaatdehydrogenen waarbij NAD+ en lactaat betrokken zijn.

8.7.2. Willekeurige substraatbinding – in dit type kan A of B eerst aan het enzym binden, gevolgd door het andere substraat en de afgifte van het product.

This type of mechanism is observed in reactions catalyzed by transferases enzyme as hexokinase catalyzed phosphorylation of glucose by ATP.

8.7.3. Theorell-Chance Sequential mechanism

It is a type of ordered sequential bisubstrate reaction in which the ternary complex does not accumulate.

8.7.4. Ping pong mechanism

de andere mogelijkheid bij bi-substraat reactie is dat een substraat, A, bindt aan het enzym en bij reactie ermee een product, P, wordt vrijgegeven en enzym verandert in een gewijzigde vorm, E’. Het tweede substraat, B, komt binnen en bindt zich met gemodificeerd enzym tot het tweede product, Q, en regenereert het enzym E.

de reacties die volgen op het bovenstaande mechanisme worden Ping-Pong of double-displacement reacties genoemd. Dit type mechanisme wordt waargenomen in reacties gekatalyseerd door aminotransferasen.

deze enzymen katalyseren de overdracht van een aminogroep van een aminozuur naar een α-ketozuur.De gevormde producten zijn een nieuw aminozuur dat overeenkomt met ketozuur en een nieuw ketozuur dat overeenkomt met het koolstofskelet van aminozuur, zoals:-

een ander voorbeeld van pingpongreactie is fosfoglyceraatmutase. Het enzym krijgt Fosfaat van één substraat en na phosphorylation van enzym, wordt het fosfaat overgebracht naar tweede substraat.

Volgende Vorige