linia analizy kinetycznej Weaver-BURK równanie Podwójna odwrotność wykresu kinetyki enzymu

8.3. W 1934 roku Lineweaver i Burk dokonali prostej matematycznej zmiany w równaniu Michaliesa-Mentena, wykreślając podwójną odwrotność stężenia substratu i szybkości reakcji.

Wykres Weavera Burka uzyskuje się poprzez wzięcie odwrotności obu stron równania michaliesa–Menterisa (MME).

na wykresie linii weaver Burk (LB) równanie Michaelisa Mentena jest przekształcane na krzywą linii prostej.

służy do oszacowania Vmax z pozycji punktu przecięcia na osi X.

• linia prosta jest dana przez Y = MX + C, gdzie C jest punktem przecięcia regresji Y na X, A M jest nachyleniem.
• jeśli wartość m wzrasta, to nachylenie wzrasta.
• jeśli wartość Vmax jest równa stałej, to wartość Km jest wysoka, a jeśli wartość Km jest stała, wartość Vmax maleje.

w tym krzywa hiperboliczna staje się linią prostą, a wartość bezwzględna punktu przecięcia linii X jest powinowactwem (1 / Km) enzymu do substratu. Punkt przecięcia osi Y wynosi 1 / Vmax. Nachylenie linii wynosi Km / Vmax. Ponownie, pierwotnie było to zrobione subiektywnie. Jest to znacznie drobniejsza metoda znajdowania najlepiej dopasowanych parametrów dla nieprzetransformowanej relacji Michaelisa-Mentena.

aplikacja

Wykres Lineweaver–Burk służy do określenia Km i Vmax,. Punkt przecięcia Y takiego wykresu jest równoważny odwrotności Vmax; punkt przecięcia x wykresu oznacza -1 / Km. Daje to szybkie, wizualne wrażenie różnych form hamowania enzymów.

8.4. Wykres Eadie–Hofstee ’ a

diagram Eadie–Hofstee ’ A jest graficzną reprezentacją kinetyki enzymów, w której szybkość reakcji jest wykreślana jako funkcja stosunku między szybkością a stężeniem substratu:

w tym równaniu Michaelisa Mentena jest reprezentowany jako

odwróć i pomnóż przez Vmax :

zastosowanie wykresu Eadie–Hofstee

szybka identyfikacja Km i Vmax

8.5. Wykres hanesa Woolfa

Graficzna reprezentacja stosunku początkowego stężenia substratu do prędkości reakcji V jest wykreślona w stosunku do stężenia substratu .

równanie Michaelisa-Mentena otrzymuje się jako

odwróć i pomnóż przez :

Rearrange :

This equation will give straight line of slope a Y-intercept of and an X-intercept of –km

Application :-

Used for determination of Km, Vmax and Vmax/Km parameters

8.6. Hamowanie enzymów

enzymy są białkami działającymi jako katalizator reakcji. Ale aktywność jest hamowana lub blokowana przez cząsteczki, które są substancjami chemicznymi (organicznymi / nieorganicznymi) w przyrodzie. Te cząsteczki lub związki nazywane są inhibitorami, a proces, w którym inaktywują enzym lub blokują jego aktywność, nazywany jest hamowaniem enzymu.

hamują odwracalnie lub nieodwracalnie aktywność katalityczną enzymu poprzez modyfikację łańcuchów bocznych aminokwasów wymaganych do aktywności enzymatycznej.

w odkrywaniu leków analogi leków są przeznaczone do detoksykacji wielu antytoksyn, ponieważ mają działanie hamujące.

8.6.1. Zasady reakcji hamowania enzymu

1. enzym wiąże się z substratem w stosunku 1 : 1 w miejscu aktywnym w układzie blokującym lub indukowanym dopasowaniem.
2. związki inhibitorów konkurują z substratem dla allosterycznego miejsca katalitycznego na zasadzie kto pierwszy, aby uzyskać kompleks substratu inhibitora enzymu lub kompleks inhibitora enzymu.
3. enzym i substrat lub inhibitory reagują ze sobą w sposób kinetyczny, który wyraża się jako stałe kinetyczne reakcji katalitycznej.
4. warunki fizjologiczne, takie jak pH, temperatura, stężenie substratu lub reagentów, określają szybkość reakcji enzymatycznych.
5. formy międzycząsteczkowe między podjednostkami enzymu, interakcje z grupą aktywną substratu lub inhibitora, właściwości fizyczne o charakterze wiążącym: elektrofilowy, hydrofilowy, nukleofilowy i metaloprotienny; wiązanie wodorowe wpływa na ogólną szybkość reakcji enzymu i sposób hamowania.

8.6.2.

8.6.2.1. Hamowanie kompetycyjne ( odwracalne): w tym przypadku występuje konkurencja pomiędzy inhibitorem a substratem dla miejsca aktywnego.

miejsce katalityczne enzymu jest zajęte przez inhibitor i jego aktywność jest hamowana. Ale hamowanie jest odwracalne. W tym przypadku powstają zarówno substrat enzymu, jak i Kompleks inhibitorów enzymu.

wpływ na powinowactwo :- gdy stężenie inhibitora wzrasta, jego powinowactwo wzrasta, ale powinowactwo substratu maleje, a wartość km wzrasta. Ale gdy stężenie substratu wzrasta, to jego powinowactwo wzrasta, a powinowactwo inhibitora maleje, a wartość km maleje, tj.,

inhibitor wiąże się z aktywnymi miejscami enzymu, co oznacza, że inhibitor konkuruje z substratem o wiązanie w miejscu aktywnym, stąd powinowactwo substratu do enzymu zmniejsza się, a tym samym zwiększa się wartość Km. Nowy km jest podany przez Km, gdzie

gdzie

I = stężenie inhibitora

KDI = stała dysocjacji inhibitora.

gdy stężenie inhibitora wzrasta, wartość km wzrasta wraz ze spadkiem powinowactwa substratu. Jeśli stała dysocjacji jest większa, kompleks inhibitora enzymu więcej, a jest mniejsza, a więc km jest mniejsza. Wartość a jest równa 1 lub większa niż 1. Nowa wartość Km to aKm

wpływ na Vmax

Vmax oblicza się przy nieskończonym stężeniu substratu.

Vmax = Kcat

przy nieskończonym stężeniu substratu wszystkie enzymy występują w postaci kompleksu substratu enzymatycznego i.e. Vmax is not affected.

Lineweaver Burk plot of competitive inhibition

8.6.2.2. Examples of Competitive Inhibitors

(a) Allopurinol :

Drug used for treatment of gout. Uric acid is formed in the body by oxidation of hypoxanthine by the enzyme xanthine oxidase. Allopurinol is structurally similar to hypoxanthine and inhibits the enzyme xanthine oxidase and reduced uric acid formation.

(B) metotreksat:

jest konkurencyjnym inhibitorem reduktazy dihydrofolianowej (DHFR). Lek ten jest stosowany w terapii nowotworowej. Jest strukturalnie podobny do kwasu foliowego, a zatem hamuje kompetycyjnie reduktazę kwasu foliowego. Zapobiega powstawaniu hydroforanu tetra. W związku z tym dochodzi do syntezy DNA.

(C) inhibitory MAO (Monoaminooksydaza):

są to, pierwsza klasa leków przeciwdepresyjnych, które zostaną opracowane. Inhibitory MAO zwiększają poziom serotoniny dopaminy poprzez hamowanie MAO. np. Katecholaminy (epinefryna i norepinefryny).

(D) Dicumarol:

ten lek jest podobny do witaminy K. Lek warfaryna działa jako lek przeciwzakrzepowy, hamując konkurencyjnie witaminę K.

8.6.3. Inhibicja niekonkurencyjna

nie ma konkurencji między inhibitorem a substratem, ponieważ miejsca przyłączeń substratu i inhibitora są różne. Inhibitor nie ma strukturalnego podobieństwa do substratu, dlatego nie może wiązać się z wolnym enzymem. Inhibitory wiążą się z kompleksem substratów enzymatycznych, które ujawniają miejsce wiązania inhibitora. Wiązanie inhibitora może powodować zniekształcenie miejsca aktywnego lub miejsca allosterycznego, które inaktywuje katalizę.

wpływ na powinowactwo:

wysokie powinowactwo inhibitora oznacza niską dysocjację kompleksu substratu enzymatycznego do substratu enzymatycznego. W ten sposób inhibitor wiąże się z innym niż aktywnym miejscem na kompleksie substratu enzymatycznego. Oznacza to, że inhibitor wykazuje powinowactwo do kompleksu ES, a nie do enzymu. Tak więc w obecności inhibitora wzrasta powinowactwo enzymu do substratu. To zmniejsza Km. Dlatego

wpływ na Vmax

Vmax oblicza się przy nieskończonym stężeniu substratu. Przy nieskończonym stężeniu substratu wszystkie enzymy mają postać kompleksu substratów enzymatycznych. Inhibitor wykazuje powinowactwo do kompleksu substratów enzymów. W ten sposób inhibitor wiąże się z kompleksem substratu enzymatycznego i zapobiega katalizie kompleksu substratu enzymatycznego do enzymu i produktu. That’s why Vmax decreases and new Vmax is given by

Inhibitor concentration increases a value increases and Vmax decreases

On putting the values of new Km and new Vmax in lineweaver burk plot, The equation is as follows :-

Uncompetitive inhibitor causes different intercepts on both Y and X-axis but same slope.

8.6.4. Inhibicja mieszana (niekonkurencyjna)

ten inhibitor nie jest podobny strukturalnie do substratu, ale może wiązać się z wolnym enzymem i kompleksem enzymatycznym.

gdy inhibitor wiąże się z enzymem z dala od miejsc aktywnych. Indukuje zmiany konformacyjne i zmniejsza jego aktywność katalityczną. Tak więc kompleksy inhibitora enzymu i inhibitora substratu enzymu stają się nieproduktywne. Stężenie substratu nie odwraca reakcji. W związku z tym hamowanie prowadzi do niezmienionych Km, ale zmniejszonych Vmax.

Wykres Burka Lineweaver służy do określania Km i Vmax w kinetyce enzymów. Punkt przecięcia Y takiego grafu jest równoważny odwrotności Vmax, punkt przecięcia x grafu reprezentuje kompetycyjne inhibitory, stąd te same Przechwyty Y (ponieważ Vmax nie ma wpływu na kompetycyjne inhibitory), ale istnieją różne slopy.

inhibitor niekonkurencyjny wytwarza Wykres z takim samym przechwyceniem X, jak Km nie ma wpływu, ale różne nachylenia z przechwyceniem Y.

8.7. Kinetyka reakcji Wielosubstratowej

w kinetyce enzymu proste reakcje obejmują Wiązanie jednego substratu z enzymem i przebieganie reakcji katalitycznych. Ten warunek nie jest powszechny. Większość reakcji biochemicznych katalizowanych przez dwa lub więcej substratów biorących udział w reakcjach. Na przykład enzym e katalizuje reakcję z udziałem dwóch substratów a i B i otrzymuje produkt P I Q.

ten rodzaj reakcji nazywa się reakcją dwuskładnikową . Reakcja ta może przebiegać na dwa sposoby:

8.7.1. Sekwencyjne

zarówno substraty A, jak i B wiążą się z enzymem E, a następnie reakcje prowadzą do uzyskania produktów P i Q

ten rodzaj reakcji nazywa się sekwencyjnymi lub prostymi reakcjami przemieszczenia, które są dalej podzielone na następujące grupy.

uporządkowane Wiązanie substratu lub uporządkowany mechanizm sekwencyjny – w tym typie jedno podłoże musi wiązać się przed drugim podłożem.

reakcja ta wskazuje na sekwencyjne Wiązanie substratów oraz sekwencyjne uwalnianie produktu. Ten typ mechanizmu obserwuje się w reakcjach katalizowanych przez dehydrogeny mleczanowe z udziałem NAD+ i mleczanu.

8.7.2. Przypadkowe Wiązanie substratu – w tym typie A lub B może wiązać się najpierw z enzymem, a następnie z drugim substratem i uwalnianiem produktu.

This type of mechanism is observed in reactions catalyzed by transferases enzyme as hexokinase catalyzed phosphorylation of glucose by ATP.

8.7.3. Theorell-Chance Sequential mechanism

It is a type of ordered sequential bisubstrate reaction in which the ternary complex does not accumulate.

8.7.4. Mechanizm Ping ponga

drugą możliwością w reakcji dwuskładnikowej jest to, że jeden substrat, A, wiąże się z enzymem i w reakcji z nim uwalniany jest produkt, P, A enzym zmienia się w zmodyfikowaną postać, E’. Drugi substrat, B, wchodzi i wiąże się ze zmodyfikowanym enzymem, dając drugi produkt, Q i regenerując enzym, E.

reakcje wywołane powyższym mechanizmem nazywane są reakcjami Ping-Pong lub double-displacement. Ten typ mechanizmu obserwuje się w reakcjach katalizowanych przez aminotransferaz.

enzymy te katalizują przeniesienie grupy aminowej z aminokwasu do kwasu α-ketonowego.Powstające produkty to nowy aminokwas odpowiadający kwasowi keto oraz nowy kwas keto odpowiadający szkieletowi węglowemu aminokwasu, taki jak: –

Innym przykładem reakcji ping ponga jest mutaza fosfoglicerynowa. Enzym otrzymuje fosforan z jednego substratu, a po fosforylacji enzymu fosforan jest przenoszony na drugi substrat.

Nextpoprzedni