tekst

wirusy doświadczają zupełnie różnych środowisk w zależności od tego, czy replikują się wewnątrz komórki gospodarza, czy są w tranzycie z jednego gospodarza do drugiego. W komórce wirus i jego składniki są narażone na środowisko redukujące, w którym potencjał redoks jest określany głównie przez glutation (18). W przeciwieństwie do tego, poza komórką wirus jest narażony na tlen i toksyczne produkty pochodzące z tlenu, takie jak nadtlenek wodoru, ponadtlenek i rodnik hydroksylowy, reaktywne gatunki, które mogą inaktywować wirusa. Aby poradzić sobie z takimi wysoce reaktywnymi związkami, Rośliny i zwierzęta wyrażają enzymy zdolne do przekształcania ich w produkty nietoksyczne. Przykładami takich enzymów są katalazy, peroksydazy i dysmutazy ponadtlenkowe (28). Tutaj opisujemy wyniki badań, które wykazują obecność katalazy wewnątrz oczyszczonego wirionu opryszczki pospolitej. Następnie przeprowadzono testy w celu ustalenia, czy katalaza wewnętrzna może chronić wirusa przed inaktywacją przez H2O2.

przeprowadzono badania katalazy z wirusem opryszczki pospolitej 1 (HSV-1), który był hodowany na komórkach Vero w hodowli i oczyszczany przez odwirowanie gradientu gęstości sacharozy. Gdy zawiesiny wirusa dostosowano do 1% H2O2, pęcherzyki tlenu zaczęły szybko tworzyć się, wskazując na obecność katalazy (Fig. 1A, lewa rurka). Pęcherzyki stały się widoczne wizualnie po kilku sekundach inkubacji w temperaturze pokojowej i nadal tworzyły się i powiększały przez co najmniej 20 minut. Nie powstają jednak pęcherzyki, jeśli azydek sodowy inhibitora katalazy został dodany do zawiesiny wirusa przed leczeniem H2O2 (Fig. 1A, z prawej). Testy były również negatywne, gdy (i) wirus został usunięty z roztworu przez odwirowanie przed dodaniem H2O2 lub (ii) kapsydy HSV-1 (kapsydy B) zostały zastąpione nienaruszonym wirusem. W podobnych badaniach nie obserwowano pęcherzyków wskazujących na obecność katalazy w przypadku oczyszczonego wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej lub ludzkiego adenowirusa 2 (Dane nie zostały przedstawione). Analiza Western blot potwierdziła obecność katalazy związanej z wirusem HSV-1, ale nie z adenowirusem, wirusem pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (VSV) lub kapsydami HSV-1 A (Fig. 1B).

Identyfikacja katalazy związanej z HSV-1 za pomocą testu enzymatycznego (A), analizy Western blot (b) i odwirowywania gradientu gęstości sacharozy (c). Panel a przedstawia probówkę zawierającą oczyszczony HSV-1 20 minut po dostosowaniu roztworu do 1% H2O2 (lewa probówka) i podobnej inkubacji, do której dodano inhibitor katalazy (2 mM azydek sodu) przed H2O2 (prawa). Zwróć uwagę na tworzenie się pęcherzyków w lewej probówce, wskazując na obecność katalazy w wirusie. Stężenie wirusa wynosiło 0,25 mg/ml w TNE (0,01 M Tris-HCl, 0,5 M NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,5), A inkubację prowadzono w temperaturze pokojowej. Wirus był szczepem KOS HSV-1, który był hodowany na monowarstwowych hodowlach komórek Vero i oczyszczany przez odwirowanie gradientu gęstości sacharozy, a miana oznaczano przez końcowe rozcieńczenie, jak opisano wcześniej (14). Panel b przedstawia wyniki testu Western blot na obecność katalazy w HSV-1, ludzkim adenowirusie 2 (HAd2), wirusie pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (VSV) i kapsydach HSV-1 A. Ludzki adenowirus 2 i wirus pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (Indiana; Szczep San Juan) hodowano na monowarstwowych kulturach komórek HeLa i Vero, odpowiednio, i oczyszczano wcześniej opisanymi procedurami (12, 17). Opublikowane metody zostały również wykorzystane do oczyszczania kapsydów HSV-1 A i B (23). Główne białka kapsydu wykryto przez zabarwienie plamy 1% Ponceau S (Górny rząd), podczas gdy katalazę wykryto przez immunostaining przeciwciałem swoistym dla katalazy (Calbiochem; króliczy poliklonal 219010; rozcieńczenie 1:5 000) (15). Należy zauważyć, że katalaza została wykryta w wirusie HSV-1, ale nie HAd2, VSV ani HSV-1 A capsids. Panel c przedstawia wyniki analizy gradientu gęstości sacharozy. Łącznie 50 µg oczyszczonego HSV-1 w 50 µl tne odwirowano na gradiencie 600-µl sacharozy w tne od 20% do 50%. Odwirowywanie trwało 45 minut przy 22 000 obr. / min w wirniku Beckman SW55 w temperaturze 4°C. gradient frakcjonowano, a poszczególne frakcje analizowano za pomocą SDS-PAGE, a następnie blotowano na difluorek poliwinylidenu (PVDF) i barwiono 1% Ponceau S. następnie blokowano i barwiono przeciwciałem specyficznym dla katalazy (które migrowało przypadkowo ze standardową katalazą; Worthington Ls001872). Zauważ, że pozycja wirusa w gradiencie (Górny rząd) pokrywa się z pozycją katalazy (dolny rząd), co sugeruje, że oba te czynniki są powiązane.

przeprowadzono eksperymenty kontrolne w celu potwierdzenia, że katalaza była związana z HSV-1, a nie z zanieczyszczeniami obecnymi w preparacie wirusa. Oczyszczony HSV – 1 wirowano W Pasmo Na gradiencie gęstości sacharozy, gradient frakcjonowano, a analizę Western blot wykorzystano do badania poszczególnych frakcji gradientu na obecność katalazy. Wyniki wykazały, że katalaza była obecna w frakcjach zawierających wirusy, ale nie w frakcjach flankujących (Fig. 1c). Wyniki interpretuje się w ten sposób, że katalaza jest związana z HSV-1, a nie z zanieczyszczeniami, takimi jak bakterie zawierające katalazę lub materiały komórkowe gospodarza w preparacie wirusa. Ponieważ Genom HSV-1 nie koduje katalazy (22), enzym związany z wirusem musi pochodzić z komórki gospodarza. Wczesne badania nad wirusem krowianki wykazały obecność katalazy wewnątrz dojrzałego wirionu (8). Poza tą obserwacją nie znamy żadnego innego zgłoszenia katalazy jako składnika struktury wirusowej.

dalsza analiza katalazy związanej z HSV-1 miała na celu określenie lokalizacji enzymu w wirionie. Przeprowadzono dwa rodzaje eksperymentów. Najpierw oczyszczony wirus poddano działaniu enzymu proteolitycznego pronazy w celu degradacji glikoprotein wirusa i wszelkich białek Nie zawartych w błonie wirionu. Spodziewano się, że wewnętrzne białka wirusowe nie ulegną zmianie, ponieważ pronaza nie krzyżuje się z dwuwarstwą lipidową wirusa (16). Po leczeniu pronazą wirus zebrano przez odwirowanie, a stopień utraty katalazy określono za pomocą analizy Western blot. Wyniki nie wykazały utraty katalazy w dwóch stężeniach testowanego wirusa (patrz pasmo katalazy na Fig. 2A, Pasy 1 i 2). Kontrole wewnętrzne wykazały, że glikoproteiny powierzchniowe wirusa GB i gH zostały rozszczepione zgodnie z oczekiwaniami (Fig. 2A; porównaj Pasy 2 i 3). Podobnie, Analiza Western blot wykazała, że glikoproteina D HSV-1 Była trawiona przez pronazę lub trypsynę w warunkach, w których katalaza nie miała wpływu (Fig. 2b). Oczyszczoną katalazę w roztworze trawiono również w tych samych warunkach. Natomiast brak degradacji wewnętrznej okrywy (UL47, UL48 i UL49)lub białek kapsydowych (UL19, UL38, UL18; Fig. 2A, Pasy 1 i 2). Wyniki są interpretowane w taki sposób, że katalaza znajduje się wewnątrz koperty HSV-1.

lokalizacja katalazy w HSV-1 przez leczenie oczyszczonych wirionów pronazą (pasy 1-3) i Tritonem X-100 (a, pasy 4 i 5) oraz przez leczenie pronazą i trypsyną (pasy 1-3). Panel a przedstawia analizę SDS-PAGE i Western blot białek obecnych w Nienaruszonym HSV-1 (pasy 3 i 4) oraz w wirionach po leczeniu pronazą (Pasy 1 i 2) i Tritonem X-100 (pasy 5). Należy zauważyć, że stwierdzono obecność katalazy w nienaruszonych wirionach (pasy 3 i 4) oraz w wirionach leczonych pronazą (Pasy 1 i 2), ale nie w wirionach po leczeniu 1% Tritonem X-100 (pas 5). Leczenie pronazą prowadzono przez trawienie oczyszczonego HSV-1 (0,25 mg/ml) z pronazą 1 mg/ml (Streptomyces griseus; Calbiochem 537088) przez 4 godziny w temperaturze 37°C. Po leczeniu pronazą wirus ponownie izolowano przez odwirowanie gradientu gęstości sacharozy przed analizą SDS-PAGE i Western blot. Leczenie preparatem Triton X-100 przeprowadzono przez dostosowanie oczyszczonego wirusa do 1% preparatu Triton X-100 w buforze tne zawierającym 10 mM ditiotreitolu (DTT) i inkubację przez 15 minut na lodzie (4°C). Otrzymane kapsydy oczyszczano następnie przez odwirowanie gradientu sacharozy przed analizą SDS-PAGE i Western blot. B) Analiza Western blot oczyszczonego HSV-1 po leczeniu in vitro pronazą lub trypsyną. Łącznie 100 µl oczyszczonego HSV-1 (1 mg/ml) dostosowano do pronazy 2 mg/ml lub trypsyny 2 mg/ml. Inkubacja kontrolna nie miała enzymu. Mieszaniny inkubowano przez 2 godziny w temperaturze 37°C, a wiriony oczyszczano z dala od enzymów przez odwirowanie na gradiencie sacharozy 20% do 50%, jak opisano w legendzie na Fig. 1. Próbki wirusów były granulowane przez odwirowanie i badane za pomocą analizy SDS-PAGE i Western blot. Plamy zostały zabarwione na katalazę (poliklon królika; patrz wyżej) i glikoproteina d (mysie przeciwciało monoklonalne DL11; prezent od Gary ’ ego Cohena i Roselyn Eisenberg; 1: 5 000). Należy zauważyć, że leczenie proteazami spowodowało trawienie glikoproteiny D, ale nie katalazy, co wskazuje, że katalaza znajduje się wewnątrz błony HSV-1.

dokładniejszą definicję lokalizacji katalazy uzyskano przez traktowanie oczyszczonego wirusa niejonowym detergentem Triton X-100 (TX-100). Podczas przeprowadzania ze świeżym wirusem, leczenie to powoduje utratę błony wirusowej, glikoprotein błonowych i prawie wszystkich 20 lub więcej białek okrywowych (wszystkie z wyjątkiem UL36, UL37 i US3) (13, 21, 27). Kapsyd zachowuje jednak swoją integralność i Żadne z głównych białek kapsydowych nie jest tracone. DNA wirusa jest zatrzymywane wewnątrz kapsydu. Eksperymenty obejmowały leczenie HSV-1 1% TX-100 i izolację otrzymanych kapsydów przez odwirowanie gradientu gęstości sacharozy. Western blot analiza następnie używać capsids dla obecność katalaza. Wyniki wykazały, że glikoproteiny wirusa i białka okrywowe zostały usunięte zgodnie z oczekiwaniami, a katalaza również została usunięta (patrz ryc. 2A, pasy 4 i 5). Eksperyment ten interpretuje się jako wskazujący, że katalaza jest obecna w okrywie HSV-1.

informacje takie jak te pokazane na Rys. 2 można wykorzystać do określenia liczby cząsteczek katalazy na wirion HSV-1 (15). Pomiar ten przeprowadzano zaczynając od dwóch identycznych aliquotów oczyszczonego wirusa. Dwa z nich wykorzystano do oznaczenia (i) liczby głównych cząsteczek białka kapsydu (UL19) z żelu barwionego na niebiesko Coomassie oraz (ii) liczby cząsteczek katalazy 60-kDa z skalibrowanego Western blot. W reprezentatywnym oznaczeniu analiza ta dała wartość 1: 207,5 dla stosunku molowego katalazy do UL19. Ponieważ istnieje 955 cząsteczek UL19 na kapsyd HSV-1, liczbę cząsteczek katalazy na kapsyd określono na 955/207, 5 lub 4,6. Drugie podobne oznaczenie dało wartość 7,1 cząsteczek katalazy. Ponieważ istnieją cztery podjednostki 60-kDa w aktywnej cząsteczce katalazy (11, 20), wyniki wskazują na obecność 1 do 2 tetramerów katalazy na wirion.

obecność katalazy wewnątrz wirionu HSV-1 sugeruje możliwość, że może ona uczestniczyć w ochronie wirusa przed uszkodzeniem oksydacyjnym przez H2O2. Alternatywnie, katalaza może być biernie włączana do HSV – 1, ponieważ łuska jest dodawana do cytoplazmy komórki gospodarza i nie ma żadnej funkcji ochronnej. Aby rozróżnić te dwie możliwości, zbadaliśmy wrażliwość oczyszczonego HSV – 1 na inaktywację przez H2O2 in vitro. HSV – 1 leczono H2O2 w obecności lub bez azydu sodowego inhibitora katalazy (NaN3), a następnie oznaczono miano wirusa (w przypadku braku inhibitora katalazy). Wyniki wykazały, że podczas gdy 50 mM H2O2 powodowało umiarkowane zmniejszenie miana (3 – do 4-krotne), w przypadku obecności NaN3 obserwowano śmiertelne działanie 106-krotne lub większe(Tabela 1). Eksperymenty kontrolne wykazały niewielkie zabijanie HSV-1 przez sam NaN3 (Tabela 1). Wyniki są interpretowane w taki sposób, że katalaza zapewnia znaczący poziom ochrony przed inaktywacją HSV-1 przez H2O2.

nie oczekuje się, że HSV-1 musiałby być chroniony przed uszkodzeniem oksydacyjnym przez H2O2, gdy jest związany z komórką gospodarza. Jak opisano powyżej, w komórce znajduje się środowisko redukujące, które zapobiegałoby tworzeniu się H2O2. Jednak poza komórką gospodarza środowisko jest utleniające, zdolne do wytwarzania H2O2 zarówno wewnątrz wirusa, jak i w otaczającym środowisku. HSV-1 napotyka to środowisko, ponieważ jest przenoszony z jednego gospodarza do drugiego, a katalaza może być zaangażowana w ochronę zakaźności HSV-1 podczas tranzytu. Katalaza związana z HSV-1 może również zapewniać ochronę przed H2O2 wytwarzanym przez bakterie komensalne lub inne źródła. Wykazano na przykład, że H2O2 wytwarzany przez pałeczki kwasu mlekowego chroni żeński przewód płciowy przed chorobami spowodowanymi zakażeniem mikrobiologicznym (4). Ze względu na wysoką szybkość katalityczną, katalaza związana z wirusem może odgrywać rolę w ochronie HSV-1 pomimo niskiej liczby kopii (1 do 2 kopii na wirion). Na przykład katalaza wątrobowa jest w stanie detoksykować dziesiątki milionów cząsteczek H2O2 na sekundę, wśród najwyższych wskaźników katalitycznych zgłoszonych dla dowolnego enzymu (2).

wszystkie wirusy z rodziny opryszczki mają osłonkę, warstwę białka, która leży między kapsydem wirusa a błoną (5, 6, 9, 13). Okrywa HSV-1 ma grubość od 40 do 50 nm i składa się z około 20 różnych gatunków białek, z których prawie wszystkie są kodowane w genomie wirusa. Białka okrywowe różnią się znacznie pod względem liczebności w wirionie z 800 kopii lub więcej głównych gatunków, takich jak UL47, UL48 i UL49 (patrz Fig. 2A, pas 3) (5, 16). Wiele białek okrywowych bierze udział we wczesnych etapach replikacji HSV – 1, takich jak aktywacja wczesnej transkrypcji genów i tłumienie syntezy białek komórek gospodarza (13, 24, 25). Okrywa jest montowana w rodzącym się wirionie HSV-1 jako pąki kapsyd zawierające DNA w pęcherzyku sieci trans-Golgiego (10). Sugeruje się, że katalaza jest włączona wraz z innymi białkami okrywowymi podczas procesu pączkowania.

w niezakażonych komórkach większość katalazy znajduje się sekwestrowana w peroksysomach (26). W celu włączenia do potomstwa HSV-1 podczas tegumentacji, jak opisano powyżej, katalaza musiałaby zostać uwolniona z peroksysomów. Sugerujemy, że może to nastąpić w wyniku rearanżacji błon cytoplazmatycznych na dużą skalę, która towarzyszy replikacji HSV-1 (1).

(19) wykazali, że zmniejszenie stężenia cytoplazmatycznego glutationu następuje natychmiast po zakażeniu komórek Vero HSV-1. Oczekuje się, że zmniejszenie stężenia glutationu spowoduje zmniejszenie potencjału redukcji cytozoli, a to zmniejszenie wydaje się nasilać replikację HSV-1. Stwierdzono, że dodatkowy glutation dostarczony w pożywce wzrostowej antagonizuje wzrost HSV-1 (19). Podobnie jak zewnętrznie dodany glutation, katalaza cytozolowa może zwiększać potencjał redukcyjny cytoplazmy poprzez usunięcie H2O2. Sugeruje się zatem, że jedną z konsekwencji włączenia katalazy do wirionów potomnych może być nasilenie wzrostu wirusa poprzez pozbawienie zainfekowanych komórek katalazy.

mała liczba cząsteczek katalazy na wirion może wyjaśniać, dlaczego nie została wykryta w analizie spektrometrycznej masy całych wirionów HSV-1 (7). Istnieje kilka białek wirionu HSV-1 o wysokiej liczbie kopii, które mogłyby przesłaniać sygnał z katalazy (na przykład istnieją tysiące kopii cząsteczek glikoproteiny i 955 kopii głównego białka kapsydu ). Obfitość katalazy nie spełnia Nieformalnego standardu detekcji za pomocą spektrometrii mas (widoczność na żelu coomassie-SDS-PAGE). W analizie spektrometrycznej HSV-1 (7, 26) wykryto peroksyredoksynę, nadtlenosomalne białko o aktywności przeciwutleniającej.

w przyszłości możliwe będzie wykorzystanie wrażliwości HSV-1 na cytotoksyczne działanie H2O2. Oczekuje się, że wirus będzie szczególnie podatny, gdy znajduje się w środowisku utleniającym poza komórką gospodarza i gdy katalaza jest hamowana.