I. U. B.: 2.7.7.7
C. A. S.: 9012-90-2
Reações Enzimáticas: (imagens será aberta em uma nova janela)

• Polimerização
• Revisão
• Primer Remoção

DNA polimerase I participa na replicação do DNA de procariotas. O crescimento da cadeia de ADN está na direcção 5′ a 3 ‘com adição na extremidade 3’ hidroxila. A nova cadeia é de base emparelhada com o modelo, e a nova cadeia e modelo são antiparalel. A DNA polimerase I é a polimerase e funções mais abundantes para preencher lacunas no DNA que surgem durante a replicação, reparação e recombinação do DNA.

história:

ADN polimerase I foi descoberta por Arthur Kornberg et al. em 1956. Seus resultados iniciais foram apresentados pela primeira vez na reunião anual de 1956 da Federação das Sociedades americanas de Biologia Experimental (FASEB) em Atlantic City, Nova Jersey. Os revisores do seu artigo inicial sugeriram que os autores se referem ao produto como “polideoxirribonucleótido” em vez de “ADN”.; O ‘ DNA ‘ só foi aprovado após um apelo ao editor-chefe, John Edsall (Friedberg 2006). Mais dois artigos foram publicados em 1958 por Lehman et al. e Bessman et al., que definitivamente estabeleceu DNA polimerase estava realizando replicação de DNA. Foi agraciado com o Nobel de química de 1959 por sua descoberta da DNA polimerase I. Em 1969, Jovin et al. elucidou a composição dos aminoácidos (Jovin et al. 1969a, b). Nesse mesmo ano, Delúcia e Cairns isolaram um E. estirpe coli com uma mutação que afectou a ADN polimerase e, surpreendentemente, descobriu que o ADN sintetizado mutante normalmente. Esta descoberta lançou dúvidas sobre o papel da DNA polimerase na replicação e levou grupos a procurar outras enzimas de replicação. Ao mesmo tempo, Klenow e colegas mostraram que o tratamento da ADN polimerase com a enzima proteolítica subtilisina (Tipo Carlsberg) resultou num aumento da actividade da polimerase e numa diminuição da actividade da exonuclease. A polimerase de DNA resultante foi isolada e foi nomeada o “fragmento de Klenow” (Klenow e Henningsen 1970a, e Klenow e Overgaard-Hansen 1970). em 1970, a DNA polimerase II de E. coli foi isolada e caracterizada pelo filho de Arthur Kornberg, Thomas Kornberg (Kornberg e gefter 1970). A DNA polimerase II também foi relatada independentemente por Knippers e por Moses e Richardson em 1970 (Moses e Richardson 1970b). Um ano depois, Thomas Kornberg e Gefter identificaram a DNA polimerase III (Kornberg e gefter 1971).o trabalho recente com a ADN polimerase I incluiu a investigação da Base molecular da especificidade do substrato através de estudos termodinâmicos (Wowor et al. 2010) and single-molecule FRET experiments (Santoso et al. 2010). Hastings et al. investigaram as interacções das cinco polimerases do ADN de E. coli durante o stress celular (Hastings et al. 2010), e Kukreti et al.os estudos efectuados têm por objectivo determinar quais os resíduos que são importantes para a actividade das exonucleases 3’ – 5 ‘ (Kukreti et al. 2008).especificidade:a síntese de ADN de

requer uma cadeia primária com uma terminação 3′-hidroxil livre recozida para uma cadeia template de ADN e os trifosfatos de desoxinucleótido formam pares de base com o modelo. A adição é na direcção 5′ a 3 ‘ com a libertação de pirofosfato. A enzima é activa com DNAs contendo aberturas de cadeia simples e também com DNAs com quebras ou cortes de cadeia simples. Sob algumas condições, os híbridos RNA-DNA e um duplex RNA podem servir como template-primer (Setlow 1972).

a actividade de exonuclease 5′ a 3 ‘associada à ADN polimerase i degrada tanto o ADN de cadeia simples como o ADN de cadeia dupla na direcção 5′ a 3′, produzindo 5′-mononucleótidos. A actividade das exonucleases 5′ a 3′ é específica para o ADN de cadeia dupla, produzindo 5’-mononucleótidos e oligonucleótidos. DNA polimerase I can also excise mismatched regions in DNA (Setlow 1972).

a estrutura semelhante das polimerases do ADN indicou que a maioria das enzimas da polimerase do ADN utiliza um mecanismo idêntico de polimerase catalisada por iões metálicos. Um íon metálico activa o 3’OH do primer para atacar o fosfato a do dNTP. O outro íon metálico estabiliza a carga negativa do oxigênio que sai e quelata os fosfatos b E g (Steitz 1999).

O fragmento de Klenow é um produto proteolítico da ADN polimerase I de E. coli que mantém a polimerização e a actividade das exonucleases de 3′ a 5′, mas que perdeu a actividade das exonucleases de 5′ a 3′.

composição:

ADN polimerase I é a enzima polimerizadora predominante encontrada na E. coli. Contém uma única ligação de dissulfureto e um grupo sulfidrilo (Jovin et al. 1969b). Cinco ADN polimerases distintas foram isoladas de E. coli e foram designadas funções I, II, III, IV e V. ADN polimerase I para preencher lacunas de ADN que surgem durante a replicação, reparação e recombinação do ADN. A DNA polimerase II também funciona na edição e revisão principalmente na cadeia retardada (Kim et al. 1997, Wagner and nohmi 2000). A ADN polimerase III é a principal enzima replicativa. DNA polimerase IV e V têm grandes locais ativos que permitem mais misincorporação base, e são, portanto, mais propensos a erros. Eles também não possuem subunidades de proofreading-exonuclease para corrigir misincorporações (Nohmi 2006, and Hastings et al. 2010). A ADN polimerase V está presente em níveis significativos apenas em células induzidas pelo SOS e a sobre-expressão restringe a síntese do ADN (Marsh e Walker, 1985).

a forma de domínio de todas as polimerases cujas estruturas são conhecidas tem sido descrita como uma” mão direita “com” polegar”,” palma “e” dedo ” domínios (Kohlstaedt et al. 1992). Acredita-se que a região da palma catalise a transferência de fosforilo, e acredita-se que a região do dedo interage com o nucleósido trifosfato de entrada e a base de modelo a que está emparelhado. Acredita-se que o polegar ajude a posicionar o ADN e a translocação (Brautigam e Steitz 1998).

características moleculares:

o gene que codifica a ADN polimerase i (polA) contém aproximadamente 3 000 pares de bases e codifica aproximadamente 1 000 resíduos de aminoácidos numa simples cadeia polipeptídica. Mesmo organismos separados por um bilhão de anos de evolução (como os gêneros Deinococcus-Thermus e E. coli) têm aproximadamente 35% de identidade de aminoácidos e aproximadamente 50% de homologia (Patel et al. 2001).

número de adesão às proteínas: P00582

peso Molecular:

• 109 kDa (Jovin et al. Fragmento de Klenow: 70 kDa (filtração de gel, Klenow e Overgaard-Hansen 1970)

pH óptimo:

• a actividade máxima é obtida a pH 7.4 com tampão de fosfato de potássio para sistemas primadores nativos de ADN ou de modelo de poli dAT (Richardson et al. 1964)
• klenow fragment: Maximal activities are obtained at 7.4 with phosphate buffer and at 8.4 com Tris-HCl buffer

Ponto Isoeléctrico:

• 5.40 (Teórica)

Coeficiente de Extinção:

Ativadores:

• Um divalent cação é necessária para a atividade
• Mg2+ na concentração de 7 mM de rendimento ótimo de atividade sob as condições de ensaio padrão (Richardson et al. A actividade enzimática é também influenciada por concentrações de catiões monovalentes tais como K+, Rb+, Cs+ e NH4+

inibidores:

• Kanchanomycin, mitomycin, bleomycin, phleomycin, ananthramycin, plurmycin A (Tanaka et al. 1965), and neomycin (Lazarus and Kitron 1973)
• Actinomycin inhibits only when guanosine and cytosine nucleotides are present (Cohen and Yielding 1965)
• Dideoxynucleoside
• Arabinosyl nucleotide triphosphate
• Deoxyuridine-5’-triphosphate and analogues of uridine and deoxyuridine with 5’-hydroxy or amino substituents (Kornberg 1974)
• Chloroquine and some of its analogs (Cohen and Yilding 1965)

Applications:

• Alta percentagem de incorporação de radioatividade para nick tradução ensaios
• Padrão de material de referência para o estudo do DNA polimerases
• Fabricação de copolímeros alternados, tais como poli d(A) e homopolymers tais como poli dG-poli dC
• fragmento de Klenow: sequenciamento de DNA (Sanger et al. 1977), preenchimento de 5 ‘overhangs and removal of 3’ overhangs to form blunt ends( Sambrook 1989), e segunda síntese de strand em mutagenesis (Gubler 1987)