Descrição do Teste

MLH1 éxons codificantes 1-19, MSH2 éxons codificantes 1-16, MSH6 éxons codificantes 1-10, e PMS2 éxons codificantes 1-15, e o 5′ e 3′ extremidades de todos os íntrons e regiões não traduzidas são analisados por seqüenciamento. A análise de eliminação / duplicação bruta determina o número de cópia genética para todos os exons de codificação de MLH1, MSH2, MSH6 e PMS2, e a codificação exon 9 do EPCAM. A inversão da codificação exons 1-7 do gene MSH2 é detectada pelo NGS e confirmada pela electroforese em gel de agarose e PCR. Foram sempre notificados achados intrónicos clinicamente significativos para além de 5 pares de bases. As variantes intrónicas de significado clínico desconhecido ou improvável não são notificadas para além de 5 pares de base da junção de balizas. O ácido desoxirribonucleico genómico (gDNA) é isolado do espécime do doente, utilizando uma metodologia padronizada e quantificada. O enriquecimento sequencial dos exões de codificação visados e dos nucleótidos intrónicos adjacentes é efetuado por uma metodologia de captura de iscos, utilizando sondas de oligonucleótidos biotinilados longos, seguidas de reação em cadeia da polimerase (PCR) e sequenciação da próxima geração (NGS). A sequenciação de Sanger é realizada para qualquer região em falta ou com cobertura de profundidade de leitura insuficiente para detecção de variante heterozigótica confiável. Variantes potencialmente homozigóticas, variantes em regiões complicadas por interferência de pseudogeno, e chamadas variantes que não satisfazem a profundidade de cobertura e os limiares de qualidade de frequência do alelo variante são verificados pela sequenciação de Sanger. É também realizada uma análise de remoção/duplicação grosseira dos MLH1, MSH2, MSH6 e PMS2 utilizando a profundidade de leitura a partir de dados NGS e EPCAM utilizando amplificação por sonda dependente de ligação multiplex (MLPA). Quaisquer alterações de número de cópias detectadas pelos NGS são confirmadas por microarray cromossómico e/ou MLPA direccionados. Se a exclusão for detectado no exon 13, 14 ou 15 de PMS2, encalhado dobro de seqüenciamento adequado exão(s) do pseudogene, PMS2CL, será realizada para determinar se a exclusão está localizado no PMS2 gene ou pseudogene. Se for detectada uma supressão no exon 9 do EPCAM, será realizada uma análise de supressão/duplicação da codificação exons 3 e 8 do EPCAM. Para o EPCAM, apenas são reportadas supressões brutas que abrangem o fim de 3′ do gene.