Taq polymerase is one of the most ubiquitous enzymes in molecular biology. Desde a sua descoberta em 19651, a Taq tornou-se a espinha dorsal da PCR e de todas as aplicações a jusante que a tecnologia permite. Esta poderosa polimerase é a escolha padrão para a maioria dos procedimentos de amplificação e clonagem, bem como testes de diagnóstico, sequenciamento de DNA de marcadores, e muito mais.o que torna a Taq polimerase tão especial? No artigo de hoje, vamos dar uma olhada nas vantagens e desvantagens da Taq, o que você precisa para obter os melhores resultados PCR da Taq polimerase, e alguns derivados Taq que podem ajudá-lo a alcançar melhores resultados para aplicações especializadas.

por que é o Taq tão amplamente utilizado para PCR?

Taq’s popularity benefits from the fact that it was the first high-temperature polymerase discovered by molecular biologists. Mas, isso está longe de ser a única razão pela qual ainda está em alta demanda hoje.a Taq polimerase tem a característica importante de ser estável a temperaturas até 95°C2. Isso é crítico porque esta é a temperatura a que o DNA denota – um passo necessário no início da reação PCR. Enquanto qualquer polimerase a temperatura moderada também se desnaturava a essa temperatura, tornando-a inútil, a Taq continua perfeitamente pronta para começar a polimerizar a amostra de ADN-alvo.

em cima disso, Taq tem a vantagem de ser mais ativo na temperatura 70-80°C range2. Está quente o suficiente para que o ADN não volte a aparecer, mas os primários que recozeram a temperaturas mais baixas também não se descolam. Assim, a Taq polimerase funciona extremamente bem às temperaturas que a maioria das reações padrão de PCR requerem.finalmente, o Taq Adapta-se às necessidades básicas de biologia molecular. A polimerase deixa produtos de cauda a, que podem ser facilmente clonados em um vetor usando um kit padrão de clonagem TA. Taq também é relativamente resiliente a sequências de DNA com uma ampla gama de conteúdo GC e não é muito exigente sobre as concentrações de DNA alvo ou dNTP.o que é que a Taq precisa para polimerizar eficazmente?

Se você simplesmente adicionou Taq polimerase por si só a uma amostra de DNA, pouco aconteceria. Isso porque, como a maioria das enzimas, a Taq precisa de uma mistura especializada de reagentes para funcionar correctamente.o tampão Taq básico inclui cloreto de potássio, cloridrato de Tris e Triton X-100. Estes produtos químicos são menos relevantes para otimizar suas reações PCR do que para manter a Taq segura durante o armazenamento no congelador – o que por si só é importante para tirar o máximo proveito de suas PCRs. Enquanto você pode fazer seu próprio buffer para rehidratar e armazenar enzima Taq liofilizada, a grande maioria da polimerase é vendida como uma mistura principal com Taq já suspenso na solução tampão necessária.

mais crítico para as suas reacções PCR é o cloreto de magnésio. O magnésio é um cofactor essencial para a Taq polimerase3. Sem ele, o Taq não será capaz de catalisar a adição de nucleótidos ao iniciador ou o crescimento da cadeia de ADN. A concentração de magnésio também importa. Como mais magnésio é adicionado a uma reação de PCR, Taq torna-se mais ativo, mas também menos específico na polimerização apenas sua cadeia de DNA alvo.devido ao papel do magnésio dependente da concentração, pode encontrar misturas Mestre Taq com magnésio já incluído, bem como misturas que o deixam de fora. Neste último caso, terá de adicionar cloreto de magnésio separadamente (o que requer um passo adicional de pipeta ao preparar as suas RCP). A vantagem é que você pode controlar a concentração exata de magnésio, para que você possa experimentar para encontrar a melhor mistura de produtividade Taq e especificidade.quais são os problemas com a Taq polimerase?

Taq é amplamente utilizado para PCRs de rotina, mas infelizmente, não é perfeito para todas as aplicações. A desvantagem mais notável para Taq é que não é a polimerase mais precisa lá fora. Taq tem uma taxa de erro de cerca de um erro por 100 mil pares de base4. Por comparação, a polimerase de revisão de Pfu é cerca de 10 vezes mais precisa. Se você está usando PCR a montante da clonagem ou sequenciamento de DNA, essa diferença na taxa de erro pode ser muito significativa.

a Taq polimerase padrão também pode ter problemas com a amplificação de sequências de ADN alvo maiores que cerca de 1 kB. Em relação a outros tipos de polimerases, Taq tem baixa processividade, o que significa que sua eficiência diminui significativamente com o comprimento do seu amplificador. Esta baixa processividade pode ser agravada pela presença de inibidores da PCR, que são comuns se você estiver trabalhando com DNA extraído de tecidos, plantas ou solo.

Finalmente, enquanto Taq polimerase é mais eficiente em temperaturas acima de 70°C, a enzima continua a trabalhar em temperaturas inferiores a 50°C. isso é problemático porque Taq, inadvertidamente, pode polimerizar primers ou não-alvo sequências de DNA quando a temperatura no seu reacção de PCR cai para permitir primers para recozer a sua sequência alvo. Como resultado, a Taq é conhecida por produzir dimers primer e outros produtos indesejados que podem ficar no caminho de aplicações a jusante, como a clonagem.

polimerases Taq especializadas para aplicações avançadas

felizmente, existem formas especializadas de Taq polimerase que resolvem alguns destes problemas. Por exemplo, highQu ALLin Taq polimerase é uma versão sintética de Taq que tem mais processividade do que o padrão Taq. Como resultado, você pode mais facilmente alcançar os resultados de amplicons de modelos de alta-GC, modelos com mais de 1 kB de comprimento, e amostras com concentrações moderadas de inibidores.outra forma comum de Taq, como o Taq de Início quente de ALLin, é projetado com um inibidor molecular para torná-lo inativo a temperaturas mais baixas. O Taq de arranque a quente só é funcional após aquecimento a 95 ° C. Isso reduz drasticamente a formação de dímeros primários e amplificadores não específicos como resultado da polimerização antes do início das reacções PCR. Como resultado, você pode obter maiores rendimentos ao trabalhar com sequências de alvo mais longas e cortar amplicons de fundo que normalmente requerem limpeza.

a conclusão

Taq polimerase tem sido a enzima escolhida tanto para aplicações de rotina como para aplicações complexas de PCR. Encaixa perfeitamente nos requisitos da reação de PCR, ao mesmo tempo em que torna simples aplicações a jusante como clonagem e sequenciamento. Embora o padrão Taq tenha alguns inconvenientes, estes são em grande parte resolvidos usando uma engenharia ou Termodinâmica Taq. Para a grande maioria das aplicações, a Taq polimerase continua a ser a enzima go-to para biólogos moleculares.Ishino S, Ishino Y. 2014. Frontiers in Microbiology 5: 465.Coleman WB, Tsongalis GJ. 2017. Diagnostic Molecular Pathology: A Guide to Applied Molecular Testing.Williams M. 2018. Sciencing

4 McInerney, Adams P, Hadi MZ. 2014. Molecular Biology International 287430.