PGD este o formă de diagnostic genetic efectuat înainte de implantare. Aceasta implică faptul că ovocitele pacientului trebuie fertilizate in vitro și embrionii păstrați în cultură până la stabilirea diagnosticului. De asemenea, este necesar să se efectueze o biopsie asupra acestor embrioni pentru a obține material pe care să se efectueze diagnosticul. Diagnosticul în sine poate fi efectuat folosind mai multe tehnici, în funcție de natura stării studiate. În general, metodele bazate pe PCR sunt utilizate pentru tulburări monogene și pești pentru anomalii cromozomiale și pentru sexarea acelor cazuri în care nu este disponibil niciun protocol PCR pentru o boală legată de X. Aceste tehnici trebuie adaptate pentru a fi efectuate pe blastomeri și trebuie testate temeinic pe modele cu o singură celulă înainte de utilizarea clinică. În cele din urmă, după înlocuirea embrionilor, surplusul de embrioni neafectați de bună calitate poate fi crioconservat, pentru a fi dezghețat și transferat înapoi într-un ciclu următor.

obținerea embrionuluiedit

în prezent, toți embrionii PGD sunt obținuți prin tehnologie de reproducere asistată, deși utilizarea ciclurilor naturale și fertilizarea in vivo urmată de lavajul uterin a fost încercată în trecut și acum este în mare parte abandonată. Pentru a obține un grup mare de ovocite, pacienții suferă stimulare ovariană controlată (COH). COH se efectuează fie printr-un protocol agonist, utilizând analogi ai hormonului de eliberare a gonadotropinei (GnRH) pentru desensibilizarea hipofizară, în asociere cu gonadotropine de menopauză umană (hMG) sau hormon foliculostimulant recombinant (FSH), fie printr-un protocol antagonist care utilizează FSH recombinant combinat cu un antagonist GnRH în funcție de evaluarea clinică a profilului pacientului (vârstă, indice de masă corporală (IMC), parametri endocrini). hCG se administrează atunci când la ecografia transvaginală se observă cel puțin trei foliculi cu diametrul mediu mai mare de 17 mm. Recuperarea ovocitelor ghidate cu ultrasunete transvaginale este programată la 36 de ore după administrarea hCG. Suplimentarea fazei luteale constă în administrarea zilnică intravaginală a 600 de grame de progesteron natural micronizat.

ovocitele sunt denudate cu atenție din celulele cumulus, deoarece aceste celule pot fi o sursă de contaminare în timpul PGD dacă se utilizează tehnologia bazată pe PCR. În majoritatea ciclurilor raportate, injecția intracitoplasmatică de spermă (ICSI) este utilizată în locul FIV. Principalele motive sunt prevenirea contaminării cu sperma reziduală aderentă la zona pellucida și evitarea eșecului neașteptat de fertilizare. Procedura ICSI se efectuează pe ovocite mature metafază-II și fertilizarea este evaluată la 16-18 ore după. Dezvoltarea embrionului este evaluată în continuare în fiecare zi înainte de biopsie și până la transferul în uterul femeii. În timpul etapei de clivaj, evaluarea embrionului se efectuează zilnic pe baza numărului, dimensiunii, formei celulare și ratei de fragmentare a blastomerilor. În ziua 4, embrionii au fost marcați în funcție de gradul lor de compactare, iar blastocistii au fost evaluați în funcție de calitatea throphectodermului și a masei celulare interioare și de gradul lor de expansiune.

proceduri de Biopsieedit

deoarece PGD poate fi efectuată pe celule din diferite stadii de dezvoltare, procedurile de biopsie variază în consecință. Teoretic, biopsia poate fi efectuată în toate etapele de preimplantare, dar au fost sugerate doar trei: pe ovocite nefertilizate și fertilizate (pentru corpuri polare, PBs), în ziua a treia embrioni în stadiul de clivaj (pentru blastomeri) și pe blastociste (pentru celule trofectoderm).

procedura de biopsie implică întotdeauna două etape: deschiderea zonei pellucida și îndepărtarea celulei(celulelor). Există abordări diferite pentru ambele etape, inclusiv mecanice, chimice și fizice (soluția acidă a lui Tyrode) și tehnologia laser pentru încălcarea zonei pellucida, extrudarea sau aspirația pentru îndepărtarea PBs și blastomerilor și hernia celulelor trophectoderm.

biopsia corpului Polar

o biopsie a corpului polar este prelevarea unui corp polar, care este o celulă haploidă mică care se formează concomitent ca o celulă de ou în timpul oogenezei, dar care, în general, nu are capacitatea de a fi fertilizată. Comparativ cu o biopsie blastocistă, o biopsie a corpului polar poate avea costuri mai mici, efecte secundare mai puțin dăunătoare și mai sensibile în detectarea anomaliilor. Principalul avantaj al utilizării corpurilor polare în DGP este că acestea nu sunt necesare pentru fertilizarea cu succes sau pentru dezvoltarea embrionară normală, asigurând astfel niciun efect dăunător pentru embrion. Unul dintre dezavantajele biopsiei PB este că oferă doar informații despre contribuția maternă la embrion, motiv pentru care pot fi diagnosticate cazuri de tulburări autozomale dominante și legate de X moștenite matern, care sunt transmise exclusiv matern, iar tulburările autozomale recesive pot fi diagnosticate doar parțial. Un alt dezavantaj este riscul crescut de eroare de diagnostic, de exemplu datorită degradării materialului genetic sau a evenimentelor de recombinare care duc la corpuri polare heterozigote.

biopsie în stadiul de clivaj (biopsie blastomeră)Edit

biopsia în stadiul de clivaj se efectuează în general în dimineața zilei a treia post-fertilizare, când embrionii în curs de dezvoltare ajung în stadiul cu opt celule. Biopsia se efectuează de obicei pe embrioni cu mai puțin de 50% din fragmente anucleate și într-un stadiu de dezvoltare cu 8 celule sau mai târziu. Se face o gaură în zona pellucida și unul sau doi blastomeri care conțin un nucleu sunt aspirați ușor sau extrudați prin deschidere.Principalul avantaj al biopsiei în stadiul de clivaj față de analiza PB este că aportul genetic al ambilor părinți poate fi studiat. Pe de altă parte, se constată că embrionii în stadiul de clivaj au o rată ridicată de mozaicism cromozomial, punând sub semnul întrebării dacă rezultatele obținute pe unul sau două blastomere vor fi reprezentative pentru restul embrionului. Din acest motiv, unele programe utilizează o combinație de biopsie PB și biopsie blastomeră. Mai mult, biopsia în stadiul de clivaj, ca în cazul biopsiei PB, produce o cantitate foarte limitată de țesut pentru diagnostic, necesitând dezvoltarea PCR cu o singură celulă și tehnici FISH.Deși teoretic biopsia PB și biopsia blastocistului sunt mai puțin dăunătoare decât biopsia în stadiul de clivaj, aceasta este încă metoda predominantă. Este utilizat în aproximativ 94% din ciclurile PGD raportate Consorțiului ESHRE PGD. Principalele motive sunt că permite un diagnostic mai sigur și mai complet decât biopsia PB și lasă încă suficient timp pentru a termina diagnosticul înainte ca embrionii să fie înlocuiți în uterul pacientului, spre deosebire de biopsia blastocistului.Dintre toate etapele de scindare, este în general de acord că momentul optim pentru biopsie este în stadiul cu opt celule. Este diagnostic mai sigur decât biopsia PB și, spre deosebire de biopsia blastocistului, permite diagnosticarea embrionilor înainte de Ziua 5. În această etapă, celulele sunt încă totipotente, iar embrionii nu sunt încă compactați. Deși s-a demonstrat că până la un sfert dintr-un embrion uman poate fi îndepărtat fără a-i perturba dezvoltarea, rămâne de studiat dacă biopsia uneia sau a două celule se corelează cu capacitatea embrionului de a se dezvolta, implanta și crește într-o sarcină pe termen lung.

nu toate metodele de deschidere a zonei pellucida au aceeași rată de succes, deoarece bunăstarea embrionului și / sau a blastomerilor poate fi afectată de procedura utilizată pentru biopsie. Forarea zonei cu soluție de acid Tyrode (ZD) a fost analizată în comparație cu disecția parțială a zonei (PZD) pentru a determina ce tehnică ar duce la sarcini mai reușite și ar avea un efect mai mic asupra embrionului și/sau blastomerilor. ZD folosește o enzimă digestivă precum pronaza, ceea ce o face o metodă de foraj chimic. Substanțele chimice utilizate în ZD pot avea un efect dăunător asupra embrionului. PZD folosește un microneedle de sticlă pentru a tăia zona pellucida, ceea ce îl face o metodă de disecție mecanică care are nevoie de obicei de mâini calificate pentru a efectua procedura. Într-un studiu care a inclus 71 de cupluri, ZD a fost efectuat în 26 de cicluri de la 19 cupluri și PZD a fost efectuat în 59 de cicluri de la 52 de cupluri. În analiza cu o singură celulă, a existat o rată de succes de 87,5% în grupul PZD și 85,4% în grupul ZD. Vârsta maternă, numărul de ovocite recuperate, rata de fertilizare și alte variabile nu au diferit între grupurile ZD și PZD. S-a constatat că PZD a dus la o rată semnificativ mai mare de sarcină (40,7% față de 15,4%), sarcină în curs de desfășurare (35,6% față de 11,5%) și implantare (18,1% față de 5,7%) decât ZD. Acest lucru sugerează că utilizarea metodei mecanice a PZD în biopsiile blastomerilor pentru diagnosticul genetic de preimplantare poate fi mai eficientă decât utilizarea metodei chimice a ZD. Succesul PZD peste ZD ar putea fi atribuit agentului chimic din ZD care are un efect nociv asupra embrionului și/sau blastomerilor. În prezent, forarea zonei folosind un laser este metoda predominantă de deschidere a zonei pellucida. Utilizarea unui laser este o tehnică mai ușoară decât utilizarea mijloacelor mecanice sau chimice. Cu toate acestea, forarea cu laser ar putea fi dăunătoare embrionului și este foarte scump pentru laboratoarele de fertilizare in vitro să folosească mai ales atunci când PGD nu este un proces predominant ca din timpurile moderne. PZD ar putea fi o alternativă viabilă la aceste probleme.

biopsia blastocistului

în încercarea de a depăși dificultățile legate de tehnicile cu o singură celulă, s-a sugerat biopsia embrionilor în stadiul de blastocist, oferind o cantitate mai mare de materie primă pentru diagnostic. S-a demonstrat că, dacă mai mult de două celule sunt prezente în același tub de probă, principalele probleme tehnice ale PCR cu o singură celulă sau FISH ar dispărea practic. Pe de altă parte, ca și în cazul biopsiei în stadiul de clivaj, diferențele cromozomiale dintre masa celulară interioară și trophectoderm (TE) pot reduce acuratețea diagnosticului, deși acest mozaicism a fost raportat a fi mai mic decât în embrionii în stadiul de clivaj.

biopsia TE s-a dovedit a avea succes la modelele animale, cum ar fi iepurii, șoarecii și primatele. Aceste studii arată că îndepărtarea unor celule TE nu este în detrimentul dezvoltării ulterioare in vivo a embrionului.

biopsia în stadiul de blastocist uman pentru PGD se realizează prin realizarea unei găuri în ZP în ziua a treia a culturii in vitro. Acest lucru permite te în curs de dezvoltare să iasă după blastulare, facilitând biopsia. În ziua a cincea post-fertilizare, aproximativ cinci celule sunt excizate din TE folosind un ac de sticlă sau energie laser, lăsând embrionul în mare parte intact și fără pierderea masei celulare interioare. După diagnosticare, embrionii pot fi înlocuiți în timpul aceluiași ciclu sau crioprezervați și transferați într-un ciclu ulterior.

există două dezavantaje ale acestei abordări, datorită stadiului în care este efectuată. În primul rând, doar aproximativ jumătate din embrionii preimplantați ajung la stadiul de blastocist. Acest lucru poate restricționa numărul de blastociste disponibile pentru biopsie, limitând în unele cazuri succesul PGD. Mc Arthur și colegii săi au raportat că 21% din ciclurile PGD inițiate nu au avut embrion adecvat pentru biopsia TE. Această cifră este de aproximativ patru ori mai mare decât media prezentată de datele consorțiului ESHRE PGD, unde PB și biopsia în stadiul de clivaj sunt metodele predominante raportate. Pe de altă parte, întârzierea biopsiei la acest stadiu târziu de dezvoltare limitează timpul pentru efectuarea diagnosticului genetic, ceea ce face dificilă refacerea unei a doua runde de PCR sau rehidridizarea sondelor de pește înainte ca embrionii să fie transferați înapoi la pacient.

eșantionarea celulelor Cumulusedit

eșantionarea celulelor cumulus poate fi efectuată în plus față de eșantionarea corpurilor polare sau a celulelor din embrion. Datorită interacțiunilor moleculare dintre celulele cumulus și ovocit, profilarea expresiei genetice a celulelor cumulus poate fi efectuată pentru a estima calitatea ovocitelor și eficiența unui protocol de hiperstimulare ovariană și poate prezice indirect aneuploidia, dezvoltarea embrionului și rezultatele sarcinii.

metode neinvazive de Screening Genetic preimplantare (NIPGS)Edit

biopsia embrionară tradițională poate fi invazivă și costisitoare. Prin urmare, cercetatorii au o incercare Continua de a gasi metode mai putin invazive pentru testarea genetica preimplantare. Studiile privind noile metode non-invazive de screening genetic preimplantare (NIPGS), cum ar fi lichidul blastocoel și mediile embrionare uzate, au fost publicate recent ca o alternativă la metodele tradiționale

testarea screeningului genetic preimplantare folosind lichidul Blastocoel (BF) în timpul unui proces normal de FIV, bunele practici de vitrificare a embrionilor cresc șansa unei sarcini sănătoase. În timpul procesului de vitrificare, o explozie dezvoltată este deshidratată și ea și cavitatea sa blastocoel se prăbușesc pentru procesul de îngheț. Există multe metode care au fost utilizate pentru a facilita colapsul, inclusiv puls laser, micropipetare repetată, puncție microneedle sau microsucție în mod normal, acest fluid ar fi apoi aruncat, cu toate acestea, cu testarea genetică preimplantare a BL, acest fluid este salvat și apoi testat pentru ADN. Se crede că acest ADN provine din celule care au trecut prin apoptoză găsite în embrionul în curs de dezvoltare

testarea genetică preimplantare folosind Mediu condiționat de Cultură blastocist (BCCM)o altă metodă pentru testarea genetică preimplantare mai puțin invazivă implică testarea mediilor de cultură în care s-a dezvoltat embrionul. S-a observat că embrionul eliberează fragmente de ADN din celulele care au murit în perioada de incubație. Cu aceste cunoștințe, oamenii de știință au motivat că ar putea izola acest ADN și să-l folosească pentru testarea genetică preimplantare beneficiile și consecințele testării genetice preimplantare mai puțin invazive în timp ce există dovezi contradictorii cu privire la faptul dacă metodele mai tradiționale de testare genetică preimplantare sunt sau nu dăunătoare embrionului există metode mai noi pentru metode de testare mai puțin invazive și la fel de eficiente. În acest sens, am apelat la testarea genetică preimplantare folosind lichid blastocoel și mediu embrionar uzat. O problemă a acestor alternative este cantitatea minimă de ADN cu care trebuie să lucrați. O altă întrebare foarte importantă este dacă această tehnologie este sau nu corectă. Ambele preocupări au fost abordate recent de Kuznyetsov. Kuznyetsov a decis să utilizeze ambele metode combinând cantitatea de ADN recuperată din ambele tehnici. Apoi, odată ce ADN-ul a fost izolat, a fost folosit pentru testarea genetică preimplantare. Rezultatele au arătat că, atunci când ambele metode de lichid blastocist și mediu uzat de embrioni au fost utilizate în combinație, au arătat o rată de cordanță pentru întreaga copie a cromozomului 87.5% în comparație cu trophectoderm, 96,4% în comparație cu întregul blastocist (standardul de aur). În plus, după amplificare folosind această nouă metodă, au fost capabili să producă 25,0-54,0 ng/ul de ADN pe probă. Cu metode tradiționale, cum ar fi trophectoderm au colectat 10 până la 44 ng/ul

tehnici de analiză Geneticăedit

fluorescente hibridizare in situ (pește) și reacția în lanț a polimerazei (PCR) sunt cele două tehnologii utilizate în mod obișnuit, de primă generație în PGD. PCR este utilizat în general pentru a diagnostica tulburările monogene, iar FISH este utilizat pentru detectarea anomaliilor cromozomiale (de exemplu, screeningul aneuploidiei sau translocațiile cromozomiale). În ultimii ani, Diverse progrese în testarea PGD au permis o îmbunătățire a exhaustivității și acurateței rezultatelor disponibile în funcție de tehnologia utilizată. Recent, a fost dezvoltată o metodă care permite fixarea plăcilor metafazice din blastomere unice. Această tehnică împreună cu peștele, m-FISH poate produce rezultate mai fiabile, deoarece analiza se face pe plăci metafazice întregi

În plus față de pește și PCR, secvențierea genomului cu o singură celulă este testată ca metodă de diagnostic genetic preimplantare. Aceasta caracterizează secvența ADN completă a genomului embrionului.

FISHEdit

peștele este metoda cea mai frecvent aplicată pentru a determina constituția cromozomială a unui embrion. Spre deosebire de cariotipuri, acesta poate fi utilizat pe cromozomi interfazici, astfel încât să poată fi utilizat pe eșantioane PBs, blastomere și te. Celulele sunt fixate pe lamele microscopului de sticlă și hibridizate cu sonde ADN. Fiecare dintre aceste sonde sunt specifice pentru o parte a unui cromozom și sunt etichetate cu un fluorocrom.

peștele dublu a fost considerat o tehnică eficientă pentru determinarea sexului embrionilor umani de preimplantare și capacitatea suplimentară de a detecta numere anormale de copii cromozomiale, ceea ce nu este posibil prin reacția în lanț a polimerazei (PCR).

în prezent, un panou mare de sonde sunt disponibile pentru diferite segmente ale tuturor cromozomilor, dar numărul limitat de fluorochromi diferiți limitează numărul de semnale care pot fi analizate simultan.

tipul și numărul de sonde care sunt utilizate pe un eșantion depinde de indicație. Pentru determinarea sexului (utilizat de exemplu atunci când un protocol PCR pentru o anumită tulburare legată de X nu este disponibil), sondele pentru cromozomii X și Y sunt aplicate împreună cu sondele pentru unul sau mai mulți dintre autozomi ca control intern al peștilor. Pot fi adăugate mai multe sonde pentru a verifica aneuploidiile, în special cele care ar putea da naștere unei sarcini viabile (cum ar fi o trisomie 21). Utilizarea sondelor pentru cromozomii X, Y, 13, 14, 15, 16, 18, 21 și 22 are potențialul de a detecta 70% din aneuploidiile găsite în avorturile spontane.

pentru a putea analiza mai mulți cromozomi pe aceeași probă, pot fi efectuate până la trei runde consecutive de pești. În cazul rearanjărilor cromozomiale, trebuie alese combinații specifice de sonde care flanchează regiunea de interes. Tehnica FISH este considerată a avea o rată de eroare între 5 și 10%.

principala problemă a utilizării peștilor pentru a studia Constituția cromozomială a embrionilor este rata crescută de mozaicism observată în stadiul de preimplantare umană. O meta-analiză a mai mult de 800 de embrioni a ajuns la rezultatul că aproximativ 75% din embrionii preimplantare sunt mozaic, dintre care aproximativ 60% sunt mozaic diploid–aneuploid și aproximativ 15% mozaic aneuploid. Li și colegii au descoperit că 40% dintre embrionii diagnosticați ca aneuploizi în ziua 3 s-au dovedit a avea o masă celulară interioară euploidă în ziua 6. Staessen și colaboratorii au descoperit că 17,5% dintre embrionii diagnosticați ca anormali în timpul PGS și supuși reanalizei post-PGD au fost găsiți că conțin și celule normale, iar 8,4% au fost găsiți extrem de normali. În consecință, s-a pus sub semnul întrebării dacă una sau două celule studiate dintr-un embrion sunt de fapt reprezentative pentru embrionul complet și dacă embrionii viabili nu sunt aruncați din cauza limitărilor tehnicii.

PCREdit

Kary Mullis a conceput PCR în 1985 ca o reproducere simplificată in vitro a procesului in vivo de replicare a ADN-ului. Profitând de proprietățile chimice ale ADN-ului și de disponibilitatea polimerazelor ADN termostabile, PCR permite îmbogățirea unei probe de ADN pentru o anumită secvență. PCR oferă posibilitatea de a obține o cantitate mare de copii ale unei anumite întinderi a genomului, făcând posibilă o analiză suplimentară. Este o tehnologie extrem de sensibilă și specifică, ceea ce o face potrivită pentru toate tipurile de diagnostic genetic, inclusiv PGD. În prezent, există multe variații diferite asupra PCR în sine, precum și asupra diferitelor metode de analiză posterioară a produselor PCR.

când se utilizează PCR în PGD, se confruntă cu o problemă care nu există în analiza genetică de rutină: cantitățile minime de ADN genomic disponibil. Deoarece PGD este efectuat pe celule unice, PCR trebuie adaptat și împins la limitele sale fizice și să utilizeze cantitatea minimă de șablon posibil: care este un fir. Aceasta implică un proces lung de reglare fină a condițiilor PCR și o susceptibilitate la toate problemele PCR convenționale, dar mai multe grade intensificate. Numărul mare de cicluri PCR necesare și cantitatea limitată de șablon face PCR unicelular foarte sensibil la contaminare. O altă problemă specifică PCR cu o singură celulă este fenomenul abandonului alelei (ADO). Se compune din non-amplificarea aleatorie a uneia dintre alelele prezente într-o probă heterozigotă. ADO compromite serios fiabilitatea PGD, deoarece un embrion heterozigot ar putea fi diagnosticat ca afectat sau neafectat, în funcție de alela care nu ar reuși să se amplifice. Acest lucru este valabil în special în PGD pentru tulburările dominante autozomale, unde ADO a alelei afectate ar putea duce la transferul unui embrion afectat.

au fost dezvoltate mai multe teste bazate pe PCR pentru diferite boli, cum ar fi genele repetate triplete asociate cu distrofia miotonică și X fragil în celule somatice umane unice, gameți și embrioni.

NGSEdit

Din 2014, secvențierea de generație următoare (NGS) este efectuată în PGT. NGS, cunoscut și sub numele de secvențiere paralelă masivă, este un grup de tehnici capabile să secvențieze cantități mari de ADN la un cost și timp rezonabil. Ne poate oferi o perspectivă generală asupra genomului embrionar complet, inclusiv a celui mitocondrial. Aceste tehnici se bazează pe secvențierea citirilor scurte în jur de 400 de baze fiecare și suprapunerea acestor citiri cu un software puternic de aliniere.

De asemenea, NGS ne permite, de asemenea, să detectăm aneuploidii în cei 24 de cromozomi și defecte cu o singură genă atunci când există o indicație de la părinții purtători. Principalul avantaj este că NGS poate combina detectarea atât a aneuploidiilor, cât și a bolilor monogene cu o singură biopsie și a redus costurile accesibile, făcându-l mai accesibil.

două exemple de NGS sunt pirosecvența și Terminatorul reversibil al colorantului.

stabilirea unui diagnosticedit

stabilirea unui diagnostic în PGD nu este întotdeauna simplă. Criteriile utilizate pentru alegerea embrionilor care urmează să fie înlocuiți după rezultatele FISH sau PCR nu sunt egale în toate centrele.În cazul peștilor, în unele centre se înlocuiesc numai embrioni care se dovedesc a fi normali din punct de vedere cromozomial (adică prezintă două semnale pentru gonozomi și autozomii analizați) după analiza unuia sau a doi blastomeri, iar atunci când sunt analizați doi blastomeri, rezultatele ar trebui să fie concordante. Alte centre susțin că embrionii diagnosticați ca monosomici ar putea fi transferați, deoarece monozomia falsă (adică pierderea unui semnal de pește într-o celulă diploidă normală) este cel mai frecvent diagnostic greșit. În aceste cazuri, nu există riscul unei sarcini aneuploide, iar embrionii diploizi normali nu se pierd pentru transfer din cauza unei erori de pește. Mai mult, s-a demonstrat că embrionii diagnosticați ca monosomici în ziua 3 (cu excepția cromozomilor X și 21), nu se dezvoltă niciodată la blastocist, ceea ce se corelează cu faptul că aceste monosomii nu sunt niciodată observate în sarcinile în curs.

diagnosticul și diagnosticul greșit în PGD folosind PCR au fost modelate matematic în lucrările lui Navidi și Arnheim și ale lui Lewis și colaboratori. Cea mai importantă concluzie a acestor publicații este că pentru diagnosticarea eficientă și precisă a unui embrion sunt necesare două genotipuri. Aceasta se poate baza pe un marker legat și pe genotipurile bolii dintr-o singură celulă sau pe genotipurile marker/boală a două celule. Un aspect interesant explorat în aceste lucrări este studiul detaliat al tuturor combinațiilor posibile de alele care pot apărea în rezultatele PCR pentru un anumit embrion. Autorii indică faptul că unele dintre genotipurile care pot fi obținute în timpul diagnosticului pot să nu fie în concordanță cu modelul așteptat al genotipurilor markerului legat, dar oferă încă suficientă încredere cu privire la genotipul neafectat al embrionului. Deși aceste modele sunt liniștitoare, ele se bazează pe un model teoretic și, în general, diagnosticul este stabilit pe o bază mai conservatoare, cu scopul de a evita posibilitatea diagnosticării greșite. Când apar alele neașteptate în timpul analizei unei celule, în funcție de genotipul observat, se consideră că fie a fost analizată o celulă anormală, fie că s-a produs contaminarea și că nu se poate stabili niciun diagnostic. Un caz în care anormalitatea celulei analizate poate fi identificată în mod clar este atunci când, folosind un PCR multiplex pentru markeri legați, în eșantion se găsesc doar alelele unuia dintre părinți. În acest caz, celula poate fi considerată ca purtând o monozomie pentru cromozomul pe care sunt localizați markerii sau, eventual, ca haploid. Apariția unei singure alele care indică un genotip afectat este considerată suficientă pentru a diagnostica embrionul ca fiind afectat, iar embrionii care au fost diagnosticați cu un genotip complet neafectat sunt preferați pentru înlocuire. Deși această politică poate duce la un număr mai mic de embrioni neafectați adecvați pentru transfer, este considerată preferabilă posibilității unui diagnostic greșit.

haplotipare genetică preimplantare

Haplotiparea genetică preimplantare (PGH) este o tehnică PGD în care un haplotip de markeri genetici care au asocieri statistice cu o boală țintă sunt identificate mai degrabă decât mutația care provoacă boala.odată ce un grup de markeri genetici asociați au fost stabiliți pentru o anumită boală, acesta poate fi utilizat pentru toți purtătorii acestei boli. În schimb, deoarece chiar și o boală monogenă poate fi cauzată de multe mutații diferite în cadrul genei afectate, metodele convenționale PGD bazate pe găsirea unei mutații specifice ar necesita teste specifice mutației. Astfel, PGH extinde disponibilitatea PGD la cazurile în care testele specifice mutației nu sunt disponibile.

PGH are, de asemenea, un avantaj față de pește, deoarece peștele nu este de obicei capabil să facă diferențierea între embrionii care posedă forma echilibrată a unei translocații cromozomiale și cei care poartă cromozomii normali omologi. Această incapacitate poate fi grav dăunătoare diagnosticului făcut. PGH poate face distincția că peștele adesea nu poate. PGH face acest lucru folosind markeri polimorfici care sunt mai potriviți la recunoașterea translocațiilor. Acești markeri polimorfici sunt capabili să distingă între embrionii care au efectuat translocații normale, echilibrate și dezechilibrate. FISH necesită, de asemenea, mai multă fixare celulară pentru analiză, în timp ce PGH necesită doar transferul celulelor în tuburi de reacție în lanț a polimerazei. Transferul de celule este o metodă mai simplă și lasă mai puțin loc pentru eșecul analizei.

transferul de embrioni și crioconservarea surplusului de embrioni

transferul de embrioni se efectuează de obicei în ziua a treia sau a cincea post-fertilizare, calendarul depinzând de tehnicile utilizate pentru PGD și de procedurile standard ale centrului FIV unde se efectuează.

odată cu introducerea în Europa a politicii de transfer unic de embrioni, care vizează reducerea incidenței sarcinilor multiple după ART, de obicei un embrion sau blastocist timpuriu este înlocuit în uter. HCG seric este determinat în ziua 12. Dacă se stabilește o sarcină, se efectuează o examinare cu ultrasunete la 7 săptămâni pentru a confirma prezența unei bătăi cardiace fetale. Cuplurile sunt, în general, sfătuiți să se supună PND din cauza, deși scăzut, riscul de misdiagnosis.

nu este neobișnuit ca după PGD să existe mai mulți embrioni potriviți pentru transferul înapoi la femeie decât este necesar. Pentru cuplurile supuse PGD, acești embrioni sunt foarte valoroși, deoarece ciclul actual al cuplului nu poate duce la o sarcină în curs. Crioconservarea embrionilor și dezghețarea și înlocuirea ulterioară le pot oferi o a doua șansă la sarcină fără a fi nevoie să refaceți procedurile greoaie și costisitoare de artă și PGD.