Introducere

nevralgia postherpetică oftalmică (PHN) este o afecțiune neuropatică invalidantă și investigată extensiv cauzată de herpes zoster și care persistă sau reapare timp de cel puțin 3 luni în zonele furnizate de divizia oftalmică a nervului trigeminal (Clasificarea IHS, 2013).1

studiile care evaluează inervația cutanată în probele de biopsie cutanată au oferit o nouă perspectivă asupra mecanismelor care stau la baza durerii neuropatice în mai multe afecțiuni (Sommer și Lauria, 2007). Biopsia cutanată este un instrument de diagnostic minim invaziv utilizat pentru a evalua fibrele nervoase din epiderma și derma umană. Inervația epidermică constă în principal din terminale de fibră c nemielinizate, cu relativ puține fibre mielinizate mici A-care își pierd teaca de mielină și ajung la epidermă ca terminații nervoase libere nemielinizate. În schimb, inervația dermică constă în principal din fibre mielinizate mari a-centimetrice care trimit ramuri către corpusculii dermici și foliculii de păr (Nolano și colab., 2003, 2013).

majoritatea studiilor morfometrice au utilizat imunohistochimia cu câmp luminos cu produsul genei proteice (PGP) 9.5 imunostimularea și inervația epidermică evaluată singură. O abordare bazată pe imunofluorescență și microscopie confocală utilizând imunostimularea dublă și triplă cu un panou extins de anticorpi incluzând markerul pan-neuronal PGP 9.5, markerul membranei bazale, colagenul IV (ColIV) și anticorpii pentru diferite populații de fibre nervoase mielinizate și nemielinizate, s-au dovedit a furniza informații distincte despre fibrele nervoase senzoriale și autonome și, eventual, să evalueze inervația pielii mai precis (Doppler și colab., 2012; Nolano și colab., 2013).

deși studiile anterioare de biopsie cutanată au arătat o pierdere severă a fibrelor nervoase epidermice (ENF) în dermatomii toracici afectați ai pacienților cu PHN (Oaklander, 2001; Petersen și colab., 2010), nu au investigat direct PHN oftalmic și nici nu au distins fibrele mielinizate epidermice nemielinizate și dermice sau au detaliat cu exactitate implicarea fibrelor nervoase autonome. Având aceste informații ar putea defini mai precis mecanismele fiziopatologice care stau la baza PHN, îmbunătățind astfel modul în care diagnosticăm și vindecăm această afecțiune neuropatică extrem de rezistentă la medicamente.

continuarea interesului nostru de cercetare în mecanismele care stau la baza durerii neuropatice în bolile nervoase periferice (Truini și colab., 2014) inclusiv PHN (Truini și colab., 2008), în acest studiu clinic și morfometric, ne-am propus să investigăm modul în care PHN oftalmic afectează fibrele nervoase senzoriale și autonome ale pielii mielinizate și nemielinizate. Pentru a face acest lucru, am luat biopsii cutanate supraorbitale de 2 mm din partea afectată și din partea oglinzii neafectate la zece pacienți cu PHN oftalmic. Am procesat probele cutanate cu imunofluorescență indirectă, am examinat probele prin microscopie confocală, am distins inervația epidermică nemielinizată și mielinizată dermică și am descris implicarea fibrelor nervoase autonome.

materiale și metode

am înrolat 10 pacienți (3 F, 7 M; 74,5 x 4,4 ani) cu PHN oftalmic în departamentul de Neurologie, Universitatea Sapienza, Roma. PHN oftalmic a fost diagnosticat în conformitate cu criteriile de diagnostic ale Societății Internaționale de cefalee: durerea persistentă sau recurentă timp de cel puțin 3 luni în zona furnizată de diviziunea oftalmică a nervului trigeminal și cauzată de herpes zoster. Criteriile de excludere au fost tulburările cognitive, alte boli ale sistemului nervos central și periferic. Niciun pacient nu a fost tratat cu medicamente pentru durere topică (adică., lidocaină și capsaicină).

Comitetul de evaluare instituțională al Departamentului de Neurologie, Policlinico Umberto I, Roma, a aprobat studiul, iar pacienții și-au dat consimțământul informat.

evaluare clinică și neurofiziologică

toți participanții au fost supuși unui examen general și unui examen neurologic, cu teste senzoriale complete incluzând simptome negative (tactil, pinprick și hipoestezie termică) și simptome pozitive (durere spontană continuă, durere paroxistică) și semne (alodinie dinamică mecanică și hiperalgezie pinprick). Prezența și severitatea simptomelor negative au fost evaluate prin compararea părții afectate cu imaginea oglindă pe partea sănătoasă. Severitatea diferitelor tipuri de durere (adică durere spontană continuă, durere paroxistică, alodinie dinamică mecanică, hiperalgezie pinprick) a fost evaluată pe o scară numerică de evaluare 0-10 (NRS; 0 = fără senzație, 10 = cea mai gravă durere posibilă).

la toți pacienții, s-a înregistrat reflexul de clipire mediat de fibre mielinizate, cu metode care respectă recomandările Federației Internaționale de ghiduri de Neurofiziologie clinică (Deuschl și Eisen, 1999). Pentru a investiga o funcție de fibră de la Centimetric și C, am înregistrat potențiale evocate cu laser, conform unei tehnici raportate anterior (Truini și colab., 2008).

biopsia cutanată

biopsiile cutanate de două mm au fost luate imediat deasupra sprâncenelor din partea afectată și neafectată a oglinzii. Rana s-a vindecat în câteva zile fără o cicatrice vizibilă (Figura 1). Probele de piele au fost prelucrate cu tehnici imunohistochimice, așa cum s-a descris anterior (Nolano și colab., 2013). Probele au fost fixate peste noapte în soluție de Zamboni, crioprotectate în zaharoză 20% în soluție salină tamponată cu fosfat și tăiate în secțiuni cu grosimea de 50-oqqm pe un Microtom de congelare (Leica 2000r, Germania). Secțiunile plutitoare libere au fost prelucrate pentru imunofluorescență indirectă folosind un panou de anticorpi pentru a pata inervația senzorială, autonomă a pielii și structurile vasculare, inclusiv pgp9.5, peptida legată de gena calcitoninei (CGRP), substanța P (SubP) și peptida intestinală vasoactivă (VIP) anticorpi (Tabelul 1). Imaginile digitale au fost achiziționate folosind microscopie confocală non-laser (sistem confocal CARV; ATTO Biosciences, SUA și sistemul confocal Apotome; Zeiss, Germania).

Figura 1. Biopsie cutanată supraorbitală de doi mm. (A) fotografia unui pacient cu nevralgie postherpetică (PHN) care prezintă rana cutanată de 2 mm imediat după pumn. (B) după 1 săptămână, cicatricea este greu vizibilă.

Tabelul 1. Abrevierea, sursa și diluarea markerilor imunohistochimici.

densitatea ENF a fost evaluată în probele de biopsie cu Punch cutanat de 2 mm prin aplicarea software-ului Neurolucida (MicroBrightField Bioscience, SUA) la patru imagini confocale din seria Z de 20 de metri cubi (2 trepte de câte 16 metri cubi), obținute din patru secțiuni selectate aleatoriu pentru fiecare probă. Fibrele nervoase mielinizate dermice au fost cuantificate folosind anticorpi proteici bazici anti-mielină pe întreaga suprafață dermică, inclusiv adâncimea de 1 mm față de membrana bazală, în trei secțiuni aleatorii pentru fiecare probă, în urma procedurii publicate anterior (Nolano și colab., 2013). Pe o imagine digitală de Mărire originală neconfocală de 5 hectare a secțiunilor pătate cu proteine bazice de mielină s-a aplicat o grilă calibrată (2 centi 1 mm) cu o serie de șapte linii paralele echidistante. Toate interceptările dintre fibrele mielinizate și liniile de rețea au fost numărate. Densitatea fibrelor nervoase mielinizate dermice a fost calculată ca numărul de fibre care interceptează grila pe zona dermică (interceptează pe mm2). Un singur operator a cuantificat orbește fibrele nervoase ale pielii în fiecare probă. VIP-ir densitatea lungimii nervului sudomotor (nm / mm3) a fost calculată folosind modulul de urmărire a nervilor Autoneuron, o parte a software-ului Neurolucida , așa cum s-a descris anterior (Provitera și colab., 2014). Pentru evaluarea fibrelor peptidergice (SubP, CGRP și VIP-ir) în plexul neuronal subepidermic, la 100 mm de membrana bazală, s-a aplicat un punctaj semicantitativ (0 = absența fibrelor, 1 = segmente de fibre rare, mai scurte de 10 mm, 2 = puține fibre, populând dermul în mare parte denervat, 3 = normal, mai multe fibre acoperind cea mai mare parte a plexului neuronal subepidermic).

rezultatele biopsiei cutanate la cei 10 pacienți au fost comparate cu un eșantion de 10 subiecți sănătoși (densitatea fibrelor nervoase epidermice: 18,9 3,7/mm, densitatea fibrelor mielinizate dermice: 6,7 1,4 / mm; Nolano și colab., 2013).

analiza statistică

toate datele sunt exprimate ca valori medii ale SD-ului inqq. Distribuția normală a densității fibrelor mielinizate epidermice și dermice a fost evaluată utilizând testul de normalitate D ‘ Agostino și Pearson omnibus. Testul Wilcoxon a fost utilizat pentru compararea variabilelor neurofiziologice și biopsiei cutanate între părțile neafectate și cele afectate. Testul Mann Whitney a fost utilizat pentru compararea variabilelor biopsiei cutanate între pacienții cu PHN și controalele normale. Corelațiile dintre densitatea ENF și durata PHN au fost calculate cu coeficientul de corelație r al lui Pearson. Valorile P mai mici sau egale cu 0,05 au fost considerate a indica semnificația statistică.

rezultate

la examenul clinic, toți cei zece pacienți s-au plâns de deficite senzoriale care implică toate modalitățile senzoriale și au raportat dureri spontane continue (NRS: 4,3 int 1,4); cinci pacienți s-au plâns, de asemenea, de alodinie dinamică mecanică (NRS: 3,5 int 0,7).

testarea neurofiziologică a arătat anomalii severe care implică toate variabilele testate. La toți pacienții, un reflex de clipire mediat de fibre, care stimulează partea afectată, a provocat răspunsuri anormale (întârziate sau absente). Pragurile de percepție Laser au fost mai mari, iar amplitudinile potențiale evocate de laserul cu Centimetrie și C au fost mai mici după stimularea părții afectate decât după stimularea părții neafectate (p < 0,05, testul Wilcoxon). La 2 din cei 10 pacienți, potențialele evocate cu laser legate de stimularea fibrei C au fost absente și în partea neafectată (Tabelul 2).

Tabelul 2. Abrevierea, sursa și diluarea markerilor imunohistochimici.

analiza imunofluorescenței Confocale a arătat că inervația pielii în biopsiile cutanate supraorbitale de la pacienții cu PHN diferă izbitor între părțile neafectate (figurile 2a,C,E) și cele afectate (figurile 2b,D,F). În timp ce probele de biopsie cutanată din partea neafectată au prezentat o inervație destul de densă și regulată, epiderma din partea afectată a apărut slab și inegal inervată cu clustere și tracturi lungi lipsite de fibre nervoase (figurile 2a–D). Semicantitative analiza a arătat că subepidermal plexul apărut sărac și nebun și, în comparație cu partea indemnă, cuprinse mai mică (p < 0.001) CGRP (1.4 ± 0.8 vs 2.5 ± 0.5), SubP (1.1 ± 0.6 vs 2.3 ± 0.7) și VIP (1.0 ± 0.7 vs 2.2 ± 0.8) imunoreactive (IR) fibre nervoase. Foliculii de păr au apărut slab inervați cu puține fibre nemielinizate și mielinizate (figurile 2F,E). Pierderea de fibre mielinizate epidermice și dermice a variat de la moderată la severă, iar 3 din cei 10 pacienți au avut denervare completă a pielii. Cei câțiva axoni epidermici supraviețuitori au fost grupați între zonele epidermei denervate. Fibrele mielinizate au prezentat mai multe anomalii morfologice, cum ar fi fragmentarea, apariția frecventă a lungimii nodale mai mari decât în mod normal (7 sau mai mult; Nolano și colab., 2003) și nereguli de calibru cu mărire și contracție (modificare a diametrului peste 100%) în cadrul aceluiași internod. Aceste caracteristici au fost rareori observate în partea neafectată. Spre deosebire de inervația senzorială, ambele componente, adrenergice și colinergice, ale inervației autonome la anexele dermice au apărut relativ conservate (Figura 3). Părțile neafectate și afectate au prezentat numeroase fibre colinergice (VIP-ir) sudomotor (figurile 3c,D) și pilomotor adrenergic (DbH-ir) (figurile 3e,F). Densitatea fibrelor nervoase colinergice sudomotorii nu a fost diferită între cele afectate(1.9 0.7 nm/mm3) și partea neafectată(2,0 0,5 Nm / mm3).

Figura 2. Inervarea pielii. Imagini confocale care prezintă inervația pielii în partea neafectată (a,C,E) și partea afectată (B,D, F) la un pacient reprezentativ cu PHN. Pierderea severă a fibrelor nervoase epidermice și dermice este vizibilă în probele de biopsie cutanată din partea afectată (B vs.a). Epiderma din partea afectată prezintă un tract lung lipsit de fibre nervoase și grupuri de fibre nervoase (D vs.C). Pierderea fibrelor nervoase nemielinizate și mielinizate în jurul foliculilor de păr (F vs.E). Bare: 100 in (A,B,E,F); 25 in (C,D).

Figura 3. Inervație autonomă a pielii. Imagini confocale care prezintă inervație autonomă la anexele dermice în partea afectată (a,C,E) și partea neafectată (B,D, F). Dermul superior din jurul foliculilor de păr din partea afectată conține mai puține fibre peptidice intestinale vasoactive-imunoreactive (VIP-IR) decât aceeași zonă dermică din partea neafectată (a VS.B), în timp ce inervația PILOMOTORIE VIP-ir și DBH-ir este bine dotată (D și F vs. C și E). Baruri: 100 in (A, B); 50 in (C,D), 25 in (E,F).

analiza cantitativă (pe baza analizei imunoreactivității proteinei bazice a PGP9.5 și a mielinei (MBP)) a probelor de biopsie cutanată a arătat o densitate semnificativ mai mică a fibrelor mielinizate epidermice și dermice în partea afectată decât în partea neafectată (3.1 3.3 și 2.1 2.8 vs.17.2 8.9 și 6.6 5.0/mm2; p < 0.01, tabelul 2). Raportul dintre fibrele nervoase mielinizate epidermice și dermice a fost semnificativ mai mic în partea afectată decât în partea neafectată (1,1 1,0 vs.4.3. 5.3; p < 0.01).

deși densitatea ENF a crescut odată cu durata PHN, această corelație nu a atins semnificația statistică (r: 0,5574, p = 0,09; Figura 4).

Figura 4. Corelația dintre densitatea fibrei nervoase epidermice (ENF) și durata PHN. Deși densitatea ENF a crescut odată cu durata PHN, această corelație a ratat semnificația statistică (fibră nervoasă epidermică: r: 0,5574, p = 0,09).

Valorile medii pentru densitățile fibrelor nervoase nemielinizate și mielinizate în partea neafectată nu au fost diferite de martor (densitatea fibrelor nervoase epidermice: 17,2 8,9/mm față de 18,9 3,7/mm; densitatea fibrelor mielinizate dermice: 6,6 5,0/mm față de 6,7 1,4/mm; p > 0.3, prin testul Mann-Whitney). Cu toate acestea, la cei doi pacienți cu potențiale anormale evocate cu laser mediate de fibre c, biopsia cutanată a arătat o pierdere de fibre nervoase mielinizate epidermice și dermice și în partea neafectată (0,8 și 3,6/mm în neafectată și 0,0 și 0.3 / mm în partea afectată).

discuție

studiul nostru clinic și morfometric, care evaluează inervația pielii în biopsiile cutanate supraorbitale cu imunofluorescență indirectă și microscopie confocală, oferă informații noi specificând că, deși PHN oftalmic afectează atât fibrele nervoase epidermice nemielinizate, cât și fibrele nervoase mielinizate dermice, afectează predominant fibrele nervoase nemielinizate și păstrează inervația cutanată autonomă.

examenul clinic a arătat că toți pacienții au avut hipoestezie tactilă, înțepătoare și caldă. În consecință, toate cele trei variabile neurofiziologice pe care le-am înregistrat (reflexul de clipire mediat de fibre A la suta, potențialele evocate cu laser a la suta si a la suta) au fost anormale. În timp ce evaluarea clinică și testarea neurofiziologică au arătat atât leziuni ale fibrelor mielinizate, cât și ale fibrelor nemielinizate, evaluarea biopsiei cutanate a specificat că deteriorarea legată de PHN a inervației pielii diferă în fibrele mielinizate și nemielinizate. Mai precis, raportul mai mic nemielinizat/mielinizat în partea afectată decât în partea oglindă neafectată sugerează o pierdere predominantă a fibrelor nervoase nemielinizate epidermice. Această nouă constatare morfometrică este de acord cu studiile anterioare care au investigat inervația epidermică singură și au arătat o pierdere variabilă de fibre nemielinizate (Oaklander, 2001; Petersen și colab., 2010; Reda și colab., 2013). Implicarea predominantă a fibrelor nervoase nemielinizate pe care o descriem la pacienții cu PHN se potrivește cu durerea lor tipică în curs de desfășurare. Acest tip de durere reflectă probabil modificările neuroplastice secundare și hiperactivitatea spontană în neuronii nociceptivi denervați anatomic de ordinul doi (Truini și colab., 2013). Datorită eșantionului mic de studiu nu am putut investiga în mod fiabil posibilele corelații între durere și anomalii clinice, neurofiziologice și morfologice. Această întrebare merită investigată într-un studiu suplimentar care înscrie mai mulți pacienți.

în acest studiu de biopsie cutanată, folosind imunofluorescență indirectă și microscopie confocală, oferim informații detaliate nedeclarate anterior despre inervația autonomă a pielii la pacienții cu PHN oftalmic. În timp ce inervația autonomă la glandele sudoripare și la mușchii pilorum erector a fost scutită, am observat o reprezentare slabă a fibrelor VIP-IR în dermul superior, în jurul vaselor și foliculilor de păr, unde a existat și o reprezentare slabă a CGRP și SubP. Unele dintre aceste fibre modulează funcția foliculului pilos și controlul vasomotor facial și pot proveni din nervul trigeminal senzorial (Izumi, 1995, 1999). Această origine poate explica implicarea lor în PHN, în timp ce fibrele nervoase neimplicate sudomotor și pilomotor VIP-IR provin probabil din ganglionii simpatici cervicali superiori și din nervii parasimpatici cranieni pe care PHN îi lasă intacti. Având în vedere că multe studii sugerează că sistemul nervos autonom ar putea participa la dezvoltarea durerii (Fields și colab., 1998), economisirea fibrelor nervoase autonome pe care le descriem aici ar putea susține cuplarea indirectă propusă între neuronii nemielinizați aferenți simpatici intacti și deteriorați (Drummond și colab., 2014).

la pacienții noștri cu biopsie cutanată oftalmică PHN, rezultatele au arătat că cei câțiva axoni supraviețuitori din partea afectată au fost grupați între zonele epidermei denervate și că densitatea ENF a avut tendința de a crește odată cu durata bolii. Această observație ne conduce la presupunerea că pielea ar putea suferi o remodelare nervoasă în timp. Aceste schimbări ar putea avea loc atunci când axonii supraviețuitori încolțesc colaterali în încercarea de a ocupa teritoriul denervat. Această remodelare anatomică poate aduce, de asemenea, unele îmbunătățiri funcționale. Desigur, ipoteza noastră care sugerează o reinervare parțială în timp la pacienții cu PHN oftalmic argumentează împotriva studiilor pivot care abordează istoria naturală a PHN toracic (Petersen și colab., 2010; Reda și colab., 2013). Aceste studii care utilizează măsuri funcționale și biopsie cutanată concluzionează că, chiar și la 7,7 ani, există doar o recuperare modestă a funcției senzoriale și nici o recuperare anatomică în ciuda rezoluției durerii la majoritatea pacienților. În special, studiul realizat de Reda și colegii săi a arătat că, deși durerea și majoritatea măsurătorilor funcției senzoriale, simptomelor senzoriale și răspunsului la capsaicină au continuat o tendință de îmbunătățire în timpul unei urmăriri pe termen lung, mulți subiecți au prezentat încă anomalii senzoriale. Deși nu putem exclude faptul că fiabilitatea constatărilor noastre ar putea fi influențată de eșantionul mic de pacienți, dacă sistemul trigeminal, un teritoriu particular, este mai predispus la reinervarea pielii decât alte zone ale corpului rămâne o întrebare interesantă pentru cercetările viitoare.

densitatea medie a fibrelor mielinizate epidermice și dermice și raportul lor în partea neafectată a oglinzii nu diferă de martor. Cu toate acestea, la doi dintre cei zece pacienți pe care i-am studiat, potențialele evocate cu laser legate de fibrele C au fost absente după stimularea părții neafectate și ambii pacienți au avut pierderi ușoare de fibre epidermice, deși mai puțin severe în partea neafectată decât în partea afectată. Această constatare este în concordanță cu studiile anterioare clinice, neurofiziologice și biopsii cutanate care arată leziuni bilaterale ale fibrelor nervoase și susține ipoteza că PHN poate provoca ocazional o implicare ușoară, subclinică a căii senzoriale aferente în partea neafectată (Haanp si colab., 1997; Oaklander și colab., 1998; Truini și colab., 2008).

studiul nostru de biopsie cutanată care arată că PHN oftalmic afectează diferențiat fibrele mielinizate epidermice și dermice și păstrează inervația autonomă a pielii oferă informații noi pentru înțelegerea mecanismelor care stau la baza acestei afecțiuni invalidante.

contribuții autor

Declarație privind conflictul de interese

autorii declară că cercetarea a fost realizată în absența oricăror relații comerciale sau financiare care ar putea fi interpretate ca un potențial conflict de interese.

note de subsol

1. ^ http://www.ihs-classification.org/_downloads/mixed/International-Headache-Classification-III-ICHD-III-2013-Beta.pdf