teksti

virukset kokevat melko erilaisia ympäristöjä riippuen siitä, lisääntyvätkö ne isäntäsolun sisällä vai siirtyvätkö ne isännästä toiseen. Solussa virus ja viruksen komponentit altistuvat pelkistyvälle ympäristölle, jossa redox-potentiaali määritetään ensisijaisesti glutationilla (18). Sen sijaan solun ulkopuolella virus altistuu hapelle ja hapesta johdetuille myrkyllisille tuotteille, kuten vetyperoksidille, superoksidille ja hydroksyyliradikaalille, reaktiivisille lajeille, jotka voivat inaktivoida viruksen. Selviytyäkseen tällaisista erittäin reaktiivisista yhdisteistä kasvit ja eläimet ilmaisevat entsyymejä, jotka pystyvät muuttamaan ne myrkyttömiksi tuotteiksi. Esimerkkejä tällaisista entsyymeistä ovat katalaasi, peroksidaasit ja superoksididismutaasi (28). Tässä kuvataan tutkimustuloksia, jotka osoittavat katalaasin läsnäolon puhdistetun herpes simplex-virionin sisällä. Tämän jälkeen suoritettiin testejä sen määrittämiseksi, voiko sisäinen katalaasi suojata virusta H2O2: n aiheuttamalta INAKTIVAATIOLTA.

katalaasia koskevat tutkimukset tehtiin herpes simplex-virus 1: llä (HSV-1), jota kasvatettiin Vero-soluissa viljelmässä ja puhdistettiin sakkaroositiheysgradientti-sentrifugoinnilla. Kun virussuspensioita säädettiin 1% H2O2: een, happikuplia alkoi muodostua nopeasti, mikä osoittaa katalaasin läsnäolon (Fig. 1A, vasen putki). Kuplat tulivat näkyviin silmämääräisesti muutaman sekunnin huoneenlämmössä tapahtuneen inkubaation jälkeen ja kasvoivat ja suurenivat vähintään 20 minuutin ajan. Ilmakuplia ei kuitenkaan muodostu, jos katalaasin estäjä natriumatsidi lisättiin virussuspensioon ennen H2O2-hoitoa (Kuva. 1A, oik.). Määritykset olivat myös negatiivisia, kun I) virus poistettiin liuoksesta sentrifugoimalla ennen H2O2: n lisäämistä tai ii) HSV-1-kapsidit (B-kapsidit) korvattiin ehjällä viruksella. Vastaavissa määrityksissä ei havaittu katalaasin esiintymistä osoittavia kuplia puhdistetun vesicular stomatitis-viruksen tai ihmisen adenovirus 2: n yhteydessä (tietoja ei näy). Western blot-analyysi vahvisti, että katalaasi liittyy HSV-1-virukseen, mutta ei adenovirukseen, vesicular stomatitis-virukseen (VSV) tai HSV-1 A-kapsideihin (Kuva. 1b).

HSV-1: een liittyvän katalaasin tunnistaminen entsyymimäärityksellä (a), Western blot-analyysillä (b) ja sakkaroosin tiheysgradientti-sentrifugoinnilla (c). Paneelissa a on putki, joka sisältää puhdistettua HSV-1: tä 20 minuuttia sen jälkeen, kun liuos on säädetty 1-prosenttiseksi H2O2: ksi (vasen putki), ja samanlainen inkubaatio, johon on lisätty katalaasin estäjää (2 mM natriumatsidia) ennen H2O2: ta (oikea). Huomaa kuplien muodostuminen vasempaan putkeen, mikä osoittaa katalaasin esiintymisen viruksessa. Viruspitoisuus oli 0, 25 mg/ml TNE: ssä (0, 01 M Tris-HCl, 0, 5 M NaCl, 1 mM EDTA, pH 7, 5) ja inkubaatio tapahtui huoneenlämmössä. Virus oli HSV-1: n KOS-kanta, jota kasvatettiin vero-solujen yksikerroksisilla viljelmillä ja joka puhdistettiin sakkaroositiheysgradientti-sentrifugoinnilla, ja titteri määritettiin päätepistelaimennoksella edellä kuvatulla tavalla (14). Paneelissa b esitetään tulokset Western blot-testistä, jossa määritetään katalaasin esiintyminen HSV-1: ssä, ihmisen adenovirus 2: ssa (HAd2), vesicular stomatitis-viruksessa (VSV) ja HSV-1 A-kapsideissa. Ihmisen adenovirus 2 ja vesicular stomatitis-virus (Indiana; San Juan-kanta) kasvatettiin hela-ja Vero-solujen yksikerroksisilla viljelmillä ja puhdistettiin aiemmin kuvatuilla menetelmillä (12, 17). Julkaistuja menetelmiä käytettiin myös HSV-1 A-ja B-kapsidien puhdistamiseen (23). Tärkeimmät kapsidiproteiinit havaittiin värjäämällä läikkä 1%: lla Ponceau S: ää (Ylärivi), kun taas katalaasi havaittiin immunosäilyttämällä katalaasille spesifistä vasta-ainetta (Calbiokhem; kanin polyklonaali 219010; 1: 5000 diluutio) (15). Huomaa, että katalaasia havaittiin HSV-1-viruksessa, mutta ei HAd2 -, VSV-tai HSV-1 A-kapsideissa. Paneelissa c esitetään sakkaroosin tiheysgradienttianalyysin tulokset. Yhteensä 50 µg puhdistettua HSV-1: tä 50 µl: ssa TNE: ssä sentrifugoitiin siten, että 600 µl: n gradientti TNE: ssä oli 20-50% sakkaroosia. Sentrifugointi kesti 45 minuuttia nopeudella 22 000 rpm Beckman SW55-roottorissa 4°C: ssa.gradientti fraktioitiin, ja yksittäiset fraktiot analysoitiin SDS-PAGE-menetelmällä, minkä jälkeen blottattiin polyvinylideenidifluoridiin (PVDF) ja värjättiin 1% Ponceau S: llä. tämän jälkeen blotti poistettiin ja värjättiin katalaasille spesifisellä vasta-aineella (joka siirtyi sattumalta standardikatalaasin kanssa; Worthington LS001872). Huomaa, että viruksen sijainti gradientissa (ylärivissä) on sama kuin katalaasin (alarivissä), mikä viittaa siihen, että nämä kaksi liittyvät toisiinsa.

tehtiin Kontrollikokeita sen varmistamiseksi, että katalaasi liittyi HSV-1: een eikä virusvalmisteessa esiintyviin epäpuhtauksiin. Puhdistettu HSV-1 sentrifugoitiin kaistaksi sakkaroositiheysgradientille, gradientti fraktioitiin ja Western blot-analyysillä testattiin yksittäisiä gradienttifraktioita katalaasin esiintymisen varalta. Tulokset osoittivat, että katalaasia oli virusta sisältävissä fraktioissa, mutta ei kylkivissä (Kuva. 1c). Tulosten tulkitaan viittaavan siihen, että katalaasi liittyy HSV-1: een eikä vierasaineisiin, kuten katalaasia sisältäviin bakteereihin tai isäntäsoluaineisiin virusvalmisteessa. Koska HSV-1-genomi ei koodaa katalaasia (22), virukseen liittyvä entsyymi on johdettava isäntäsolusta. Varhaiset tutkimukset vaccinia-viruksella osoittivat, että katalaasia on täysikasvuisen virionin (8) sisällä. Tämän havainnon lisäksi emme tiedä mitään muuta raporttia katalaasista viruksen rakenteen osana.

HSV-1: een liittyvän katalaasin lisäanalyysillä pyrittiin määrittämään entsyymin sijainti virionissa. Kahdenlaisia kokeita tehtiin. Ensin puhdistettua virusta hoidettiin proteolyyttisellä pronaasientsyymillä hajottamaan viruksen glykoproteiineja ja virionin kalvoon kuulumattomia proteiineja. Sisäisten virusproteiinien odotettiin säilyvän ennallaan, sillä pronaasi ei läpäise viruksen lipidikaksikkoa (16). Pronaasikäsittelyn jälkeen virus korjattiin sentrifugoimalla, ja katalaasihäviön laajuus määritettiin Western blot-analyysillä. Tulokset eivät osoittaneet, että katalaasi häviäisi kahdessa testatussa viruspitoisuudessa (KS.Katalaasialue Kuvassa. 2A, kaistat 1 ja 2). Sisäiset kontrollit osoittivat, että viruksen pintaglykoproteiinit gB ja gH jakautuivat odotetusti (Kuva. 2A; vertaa kaistoja 2 ja 3). Samoin Western blot-analyysi osoitti, että HSV-1-glykoproteiini D pilkkoutui pronaasin tai trypsiinin vaikutuksesta olosuhteissa, joissa katalaasi ei vaikuttanut (Kuva. 2b). Myös liuoksessa oleva puhdistettu katalaasi pilkkoutui samoissa olosuhteissa. Sen sijaan sisäisen tegumentin (UL47, UL48 ja UL49) tai kapsidiproteiinien (UL19, UL38, UL18; Fig. 2A, kaistat 1 ja 2) havaittiin. Tulosten tulkitaan osoittavan, että katalaasi sijaitsee HSV-1-kuoren sisällä.

katalaasin lokalisointi HSV-1: een käsittelemällä puhdistettuja virioneja pronaasilla (kaistat 1-3) ja Triton X-100: lla (a, kaistat 4 ja 5) sekä pronaasi-ja trypsiinikäsittelyllä (b, kaistat 1-3). Paneelissa a esitetään SDS-sivu-ja Western blot-analyysi proteiineista, joita esiintyy ehjässä HSV-1: ssä (kaistat 3 ja 4) ja virioneissa pronase-hoidon jälkeen (kaistat 1 ja 2) ja Triton X-100 (kaista 5). Huomaa, että katalaasia havaittiin olevan ehjissä virioissa (kaistat 3 ja 4) ja pronaasilla hoidetuissa virioissa (kaistat 1 ja 2), mutta ei virioneissa 1% Triton X-100-hoidon jälkeen (kaista 5). Pronaasikäsittely suoritettiin sulattamalla puhdistettu HSV-1 (0, 25 mg/ml) 1 mg/ml: lla pronaasia (Streptomyces griseus; Calbiochem 537088) 4 tunnin ajan 37°C: n lämpötilassa.pronaasikäsittelyn jälkeen virus eristettiin uudelleen sakkaroositiheysgradienttisentrifugoimalla ennen SDS-PAGE-ja Western blot-analyysiä. Triton X-100-hoito suoritettiin säätämällä puhdistettu virus 1-prosenttiseksi Triton X-100: ksi TNE-puskurissa, joka sisälsi 10 mM ditiotreitolia (DTT), ja inkuboimalla 15 minuuttia jäällä (4°c). Näin saadut kapsidit puhdistettiin sakkaroosigradientti sentrifugoimalla ennen SDS-PAGE-ja Western blot-analyysiä. (b) puhdistetun HSV-1: n Western blot-analyysi pronaasi-tai trypsiinikäsittelyn jälkeen In vitro. Yhteensä 100 µl puhdistettua HSV-1: tä (1 mg/ml) säädettiin 2 mg/ml pronaasiksi tai 2 mg/ml trypsiiniksi. Kontrollihautomossa ei ollut entsyymiä. Seoksia inkuboitiin 2 tunnin ajan 37°C: n lämpötilassa, ja virionit puhdistettiin entsyymeistä sentrifugoimalla 20-50 prosentin sakkaroosigradientillä, kuten legendasta kuvioon on kuvattu. 1. Virusnäytteet pelletoitiin sentrifugoimalla ja tutkittiin SDS-PAGE-ja Western blot-analyyseillä. Pilkkuja värjättiin katalaasille (kanin polyklonaali; katso yllä) ja glykoproteiini D (hiiren monoklonaalinen vasta-aine DL11; lahja Gary Cohenilta ja Roselyn Eisenbergiltä; 1:5 000). Huomaa, että proteaasihoito aiheutti glykoproteiini D: n pilkkoutumista, mutta ei katalaasia, mikä osoittaa, että katalaasi sijaitsee HSV-1-kalvon sisällä.

tarkempi määritelmä katalaasin sijainnille saatiin käsittelemällä puhdistettua virusta ionittomalla pesuaineella Triton X-100 (TX-100). Tuoreella viruksella suoritettuna tämä hoito aiheuttaa viruksen kalvon, kalvon glykoproteiinien ja lähes kaikkien vähintään 20 valkuaisaineen menetyksen (UL36, UL37 ja US3) (13, 21, 27). Kapsidi kuitenkin säilyttää eheytensä,eikä yksikään tärkeimmistä kapsidiproteiineista häviä. Viruksen DNA säilyy kapsidin sisällä. Kokeisiin kuului HSV-1: n käsittely 1% TX-100: lla ja tuloksena olevien kapsidien eristäminen sakkaroosin tiheysgradientin sentrifugoinnilla. Western blot-analyysiä käytettiin sitten kapsidien testaamiseen katalaasin esiintymisen varalta. Tulokset osoittivat, että viruksen glykoproteiinit ja kuoriproteiinit poistuivat odotetusti ja että myös katalaasi poistui (KS. 2A, kaistat 4 ja 5). Tämän kokeen tulkitaan osoittavan, että HSV-1: ssä on katalaasia.

tiedot, kuten kuvassa. 2: n avulla voidaan määrittää KATALAASIMOLEKYYLIEN määrä HSV-1-virionia (15) kohti. Tämä mittaus suoritettiin alkaen kahdesta identtisestä puhdistetun viruksen alikiintiöstä. Näitä kahta käytettiin määritettäessä (i) capsid-proteiinimolekyylien määrää (UL19) coomassien siniseksi värjätystä geelistä ja (ii) 60-kDa-katalaasimolekyylien määrää kalibroidusta Western blotista. Edustavassa määrityksessä tämä analyysi antoi katalaasin MOOLISUHTEELLE arvon 1: 207, 5 UL19: lle. Koska yhtä HSV-1 kapsidia kohden on 955 UL19 molekyyliä, katalaasimolekyylien määräksi kapsidia kohden määritettiin 955/207, 5 tai 4,6. Toisessa vastaavassa määrityksessä saatiin 7,1 katalaasimolekyylin arvo. Koska aktiivisessa katalaasimolekyylissä (11, 20) on neljä 60-kDa: n alayksikköä, tulosten mukaan virionia kohden on 1-2 katalaasitetrameria.

katalaasin esiintyminen HSV-1-virionin sisällä viittaa siihen, että se saattaa osallistua viruksen suojaamiseen H2O2: n aiheuttamilta oksidatiivisilta vaurioilta. Vaihtoehtoisesti katalaasi voi sitoutua passiivisesti HSV-1: een, koska se on lisätty isäntäsolun sytoplasmaan eikä sillä ole suojaavaa tehtävää. Näiden kahden mahdollisuuden erottamiseksi tutkimme puhdistetun HSV-1: n herkkyyttä Inaktivoinnille H2O2in vitro-menetelmällä. HSV-1: tä hoidettiin H2O2: lla joko katalaasin estäjän natriumatsidin (NaN3) läsnä ollessa tai ilman sitä, ja viruksen titteri määritettiin sen jälkeen (katalaasin estäjän puuttuessa). Tulokset osoittivat, että vaikka 50 mM H2O2 pienensi titteriä hieman (3 – 4-kertaisesti), nan3: n esiintyessä havaittiin 106-kertainen tai suurempi tappava vaikutus (Taulukko 1). Kontrollikokeet osoittivat vain vähän HSV-1: n tappamista pelkällä NaN3: lla (Taulukko 1). Tulosten tulkitaan osoittavan, että katalaasi tarjoaa merkittävän suojan HSV-1: n inaktivoitumista vastaan H2O2: n vaikutuksesta.

ei ole odotettavissa, että HSV-1: tä tarvitsisi suojata H2O2: n aiheuttamilta oksidatiivisilta vaurioilta sen ollessa yhteydessä isäntäsoluun. Kuten edellä on kuvattu, solun sisällä on pelkistävä ympäristö, joka estäisi H2O2: n muodostumisen. Isäntäsolun ulkopuolella ympäristö on kuitenkin hapettava, joka kykenee tuottamaan H2O2: ta sekä viruksen sisällä että sitä ympäröivässä väliaineessa. HSV-1 kohtaisi tämän ympäristön, kun se siirtyy isännästä toiseen, ja katalaasi voi osallistua HSV-1-infektiivisyyden suojaamiseen kuljetuksen aikana. HSV-1: een liittyvä katalaasi voi myös antaa suojan vastaavanlaisten bakteerien tai muiden lähteiden tuottamalta H2O2: lta. Esimerkiksi laktobasillien tuottaman H2O2: n on osoitettu suojaavan naisen sukuelimiä mikrobitartunnan aiheuttamalta taudilta (4). Suuren katalyyttinopeutensa vuoksi virukseen liittyvällä katalaasilla voi olla rooli HSV-1: n suojaamisessa huolimatta sen pienestä kopiomäärästä (1-2 kopiota virionia kohti). Esimerkiksi maksakatalaasi kykenee detoksifioimaan kymmeniä miljoonia H2O2-molekyylejä sekunnissa, mikä on korkeimpia minkä tahansa entsyymin katalyyttinopeuksia (2).

kaikilla herpesperheen viruksilla on kuori, valkuaiskerros, joka on viruksen kapsidin ja kalvon välissä (5, 6, 9, 13). HSV-1: n paksuus on 40-50 nm ja se koostuu noin 20 erillisestä proteiinilajista, joista lähes kaikki ovat viruksen genomin koodaamia. Valkuaisaineet eroavat huomattavasti runsaudeltaan virionissa, jossa on 800 kopiota tai enemmän päälajeja, kuten UL47, UL48 ja UL49 (KS. 2A, kaista 3) (5, 16). Monet kuoriproteiinit osallistuvat HSV-1: n replikaation varhaisiin vaiheisiin, kuten varhaisen geenin transkription aktivointiin ja isäntäsolun proteiinisynteesin vaimenemiseen (13, 24, 25). Siemenaihe kootaan orastavaan HSV-1-virioniin DNA: ta sisältävänä kapsidisilmuna Trans-Golgi-verkoston vesikkeliin (10). On ehdotettu, että katalaasi sisällytetään muiden valkuaisaineiden kanssa orastavan prosessin aikana.

infektoimattomissa soluissa suurin osa katalaasista on eristyksissä peroksisomeissa (26). Jotta katalaasi voidaan yhdistää jälkeläisiin HSV-1 tegumentaation aikana edellä kuvatulla tavalla, sitä on vapautettava peroksisomeista. Ehdotamme, että tämä saattaa johtua SYTOPLASMAKALVOSTOJEN laajamittaisesta uudelleenjärjestelystä, joka liittyy HSV-1: n replikaatioon (1).

Palamara ym. (19) ovat osoittaneet, että sytoplasmaisen glutationin pitoisuus vähenee nopeasti sen jälkeen, kun Vero-solut ovat saaneet HSV-1-tartunnan. Glutationipitoisuuden pienenemisen odotetaan aiheuttavan sytosolien pelkistyspotentiaalin pienenemisen, ja tämä lasku näyttää voimistavan HSV-1: n replikaatiota. Kasvualustan sisältämän ylimääräisen glutationin havaittiin antagonisoivan HSV-1-kasvua (19). Kuten ulkoisesti lisätty glutationi, sytosolikatalaasi voi lisätä sytoplasman pelkistyspotentiaalia poistamalla H2O2: n. Tämän vuoksi on ehdotettu, että yksi seuraus katalaasin liittymisestä jälkeläisten virioneihin voi olla viruksen kasvun voimistuminen siten, että infektoituneet solut riistävät katalaasin.

katalaasimolekyylien pieni määrä virionia kohti saattaa selittää, miksi sitä ei havaittu kokonaisten HSV-1-virionien massaspektrometrisessä analyysissä (7). On olemassa useita korkean kopioluvun HSV-1 virion-proteiineja, jotka voivat hämärtää katalaasin signaalia (esimerkiksi glykoproteiinimolekyylejä on tuhansia kopioita ja pääkapsidiproteiinia 955 kappaletta ). Katalaasin runsaus ei täytä epävirallista standardia massaspektrometrialla (näkyvyys Coomassie-värjätyllä SDS-SIVUGEELILLÄ). Peroksiredoksiini, peroksisominen proteiini, jolla on antioksidantti, havaittiin HSV-1: n (7, 26) massaspektrometrisessä analyysissä.

tulevaisuudessa saattaa olla mahdollista hyödyntää HSV-1: n herkkyyttä H2O2: n sytotoksisille vaikutuksille. Viruksen oletetaan olevan erityisen haavoittuva, kun se on hapettavassa ympäristössä isäntäsolun ulkopuolella ja kun katalaasi on estynyt.