kinetikai analízis Line WEAVER-BURK egyenlet kettős reciprok PLOT enzim kinetika

8.3. Lineweaver-Burk-egyenlet (kettős reciproka) :

1934 –ben a Lineweaver és Burk egyszerű matematikai változtatást hajtott végre a Michalies-Menten-egyenletben a szubsztrátkoncentráció és a reakciósebesség kettős inverzének ábrázolásával.

Line weaver Burk plot a michalies–Menteris egyenlet (MME) mindkét oldalának viszonosságával kapjuk meg.

a vonal weaver Burk (LB) telek a Michaelis Menten egyenlet alakítjuk egyenes vonal görbe.

a Vmax becslésére szolgál az X tengelyen lévő intercept helyzetéből.

• egyenes vonal y = MX + C, ahol C Y az Y regressziójának metszése X-en, M pedig lejtőn.
• ha az M érték növekszik, akkor a meredekség növekszik.
• ha a Vmax értékét állandóvá tesszük, akkor a Km értéke magas, és ha a Km értéke állandó, a Vmax értéke csökken.

ebben a hiperbolikus görbe egyenes vonalúvá válik, és a vonal X-interceptumának abszolút értéke a szubsztrát enzim affinitása (1/Km). Az Y-intercept 1 / Vmax. A vonal lejtése Km / Vmax. Ismét eredetileg ez szubjektív módon történt. Ez a sokkal finomabb módszer a nem átalakított Michaelis-Menten kapcsolat legmegfelelőbb paramétereinek megtalálására.

alkalmazás

A Lineweaver–Burk telek a Km és a Vmax meghatározására szolgál. Egy ilyen gráf Y-metszete megegyezik a Vmax inverzével; a gráf X-metszete -1/Km. Gyors, vizuális benyomást kelt az enzim gátlás különböző formáiról.

8.4. Eadie–Hofstee Plot

Eadie–Hofstee diagram az enzim kinetika grafikus ábrázolása, amelyben a reakciósebességet az arány és a szubsztrát koncentráció közötti arány függvényében ábrázolják:

ebben a Michaelis Menten egyenletben

:

Eadie–Hofstee Plot

Km és Vmax gyors azonosítása

8.5. Hanes Woolf Plot

A kiindulási szubsztrátkoncentráció és a v reakciósebesség arányának grafikus ábrázolása a szubsztrátkoncentráció ellen van ábrázolva .

A Michaelis-Menten egyenlet

:

Rearrange :

This equation will give straight line of slope a Y-intercept of and an X-intercept of –km

Application :-

Used for determination of Km, Vmax and Vmax/Km parameters

8.6. Enzim gátlás

az enzimek a reakciók katalizátoraként ható fehérjék. De vannak olyan molekulák, amelyek kémiai anyagok (szerves / szervetlen), gátolják vagy blokkolják az aktivitást. Ezeket a molekulákat vagy vegyületeket inhibitoroknak nevezik, és az enzim inaktiválásának vagy aktivitásának blokkolásának folyamatát enzimgátlásnak nevezik.

az enzim katalitikus aktivitását reverzibilisen vagy visszafordíthatatlanul gátolják az enzimaktivitáshoz szükséges aminosav oldalláncok módosításával.

a kábítószer-felfedezésben a gyógyszer-analógok számos Antitoxin méregtelenítésére szolgálnak, mivel gátló hatásuk van.

8.6.1. Az enzimgátlási reakciók által követett szabályok

1. az enzim 1 : 1 arányban kötődik a szubsztráthoz aktív helyen, zárkulcsos elrendezésben vagy indukált illeszkedésben.
2. az inhibitor vegyületek először versenyeznek az alloszterin katalitikus hely szubsztrátjával, hogy enzim inhibitor szubsztrát komplexet vagy enzim inhibitor komplexeket hozzanak létre.
3. az enzim és a szubsztrát vagy inhibitorok kinetikus módon reagálnak egymással, amelyet katalitikus reakció kinetikus állandójaként fejeznek ki.
4. élettani körülmények, mint a pH, a hőmérséklet, a szubsztrát vagy a reaktánsok koncentrációja határozza meg az enzimatikus reakciók sebességét.
5. intermolekuláris formák enzim alegységek, szubsztrát vagy inhibitor aktív csoport kölcsönhatások között, kötési természet fizikai tulajdonságai: elektrofil, hidrofil, nukleofil és metalloprotien természet; a hidrogénkötés befolyásolja a teljes enzimreakció sebességét és a gátlás módját.

8.6.2. Az Inreverzibilis enzim gátlás típusai

8.6.2.1. Kompetitív gátlás ( reverzibilis): ebben az inhibitor és az aktív hely szubsztrátja közötti verseny áll fenn.

az enzim katalitikus helyét inhibitor foglalja el, és aktivitását gátolja. De a gátlás reverzibilis. Ebben az esetben mind az enzim szubsztrát, mind az enzim inhibitor komplex képződik.

affinitásra gyakorolt hatás: – ha az inhibitor koncentrációja növeli az affinitását, de a szubsztrát affinitása csökken, és a Km-érték növekszik. De amikor a szubsztrát koncentrációja nő, akkor az affinitása növekszik, az inhibitor affinitása csökken, a Km-érték pedig csökken, azaz,

A gátló kötődik aktív oldalak egy enzimek ez azt jelenti, hogy a gátló versenyez szubsztrát kötelező az aktív az oldalon, ezért affinitása a szubsztrát felé enzim csökken, ezért Km értéket növeli. Az új km-t a Km adja meg, ahol

ahol

I = inhibitor koncentrációja

KDI = az inhibitor disszociációs állandója.

az inhibitor koncentráció növekedésével a km érték növekszik, mivel a szubsztrát affinitása csökken. Ha disszociációs állandó több, enzim inhibitor komplex több, a kevesebb, így km kevesebb. Az a értéke egyenlő 1 vagy nagyobb, mint 1. A Km Új értéke aKm

hatása Vmax

Vmax kiszámítása végtelen szubsztrát koncentrációban történik.

Vmax = Kcat

végtelen szubsztrátkoncentráció esetén minden enzim I enzim szubsztrát komplex formájában van jelen.e. Vmax is not affected.

Lineweaver Burk plot of competitive inhibition

8.6.2.2. Examples of Competitive Inhibitors

(a) Allopurinol :

Drug used for treatment of gout. Uric acid is formed in the body by oxidation of hypoxanthine by the enzyme xanthine oxidase. Allopurinol is structurally similar to hypoxanthine and inhibits the enzyme xanthine oxidase and reduced uric acid formation.

(b) metotrexát:

a dihidrofolát-reduktáz (DHFR) kompetitív inhibitora. Ezt a gyógyszert rákterápiára használják. Szerkezetileg hasonló a folsavhoz, így versenyképes módon gátolja a folát-reduktázt. Megakadályozza a tetra-hidrofolát képződését. Ezért a DNS-szintézis szenved.

(C) MAO-gátlók (Mono-amin-oxidáz) :

az antidepresszánsok első osztályába tartoznak. A MAO-gátlók növelik a szerotonin dopamin szintjét a MAO gátlásával. pl. Katekolaminok (epinefrin és norepinefrinek).

(d) Dicumarol :

Ez a gyógyszer hasonló vitamin K. Kábítószer-warfarin jár, mint egy antikoaguláns által versenyképes gátló-vitamin K.

8.6.3. Nem versenyképes gátlás

nincs verseny az inhibitor és a szubsztrát között, mivel a szubsztrát és az inhibitor kötődési helyei eltérőek. Az inhibitornak nincs szerkezeti hasonlósága a szubsztráttal, ezért nem képes kötődni a szabad enzimhez. Az inhibitorok olyan enzim szubsztrát komplexhez kötődnek, amely inhibitor kötőhelyet mutat. Az inhibitor kötődése torzíthatja az aktív helyet vagy az alloszterikus helyet, amely inaktiválja a katalízist.

az affinitásra gyakorolt hatás :

az inhibitor nagy affinitása az enzim szubsztrátkomplexnek az enzim szubsztrát szubsztráthoz való alacsony disszociációját jelenti. Ebben az inhibitor az enzim szubsztrát komplex más, majd aktív helyéhez kötődik. Ez azt jelenti, hogy az inhibitor affinitást mutat az ES komplexhez, inkább az enzimhez. Így inhibitor jelenlétében az enzim affinitása a szubsztrát felé nő. Ez csökkenti a Km. Ezért

A Vmax-ra gyakorolt hatás

a Vmax-ot végtelen szubsztrátkoncentrációval kell kiszámítani. Végtelen szubsztrátkoncentráció esetén az összes enzim enzim enzim szubsztrát komplex formájában van. Az inhibitor affinitást mutat az enzimek szubsztrát komplexéhez. Így inhibitor kötődik enzimek szubsztrát komplex és megakadályozza a katalízis enzim szubsztrát komplex enzim és termék. That’s why Vmax decreases and new Vmax is given by

Inhibitor concentration increases a value increases and Vmax decreases

On putting the values of new Km and new Vmax in lineweaver burk plot, The equation is as follows :-

Uncompetitive inhibitor causes different intercepts on both Y and X-axis but same slope.

8.6.4. Vegyes (nem kompetitív) gátlás

ez az inhibitor szerkezetileg nem hasonlít a szubsztráthoz, de képes kötődni a szabad enzimhez és az enzim alállomás komplexhez is.

amikor az inhibitor az aktív helyektől távol kötődik az enzimhez. A konformációs változásokat indukálja és csökkenti katalitikus aktivitását. Így az enzim inhibitor és enzim szubsztrát inhibitor komplexek nem produktívak. A szubsztrát koncentrációja nem fordítja vissza a reakciót. Ezért a gátlás változatlan Km-hez vezet, de csökkenti a Vmax-ot.

Lineweaver Burk plot a Km és a Vmax enzimkinetikában történő meghatározására szolgál. Az Y-tengellyel egy ilyen grafikon egyenértékű az inverz Vmax X állandója a grafikon mutatja a versenyképes gátlók ezért az azonos Y-metszet (mint Vmax nem érinti a versenyképes gátlók), de vannak különböző löttyöt.

nem kompetitív inhibitor termel telek azonos X-intercept Km nem érinti, de különböző lejtőkön Y-intercepts.

8.7. A Multiszubstrát reakció kinetikája

az enzim kinetikájában az egyszerű reakciók egy enzimhez kötődő és katalitikus reakciókon átesett szubsztrátot tartalmaznak. Ez a feltétel nem gyakori. A legtöbb biokémiai reakciók katalizált két vagy több szubsztrátok részt vesz a reakciók. Például egy e enzim katalizálta a reakciót két A és B szubsztráttal, és így a termék P és q.

ezt a típusú reakciót Bi-szubsztrát reakciónak nevezzük . Ezek a reakciók kétféleképpen folytathatók:

8.7.1. Szekvenciális

Mind a szubsztrátok B, bind, hogy az enzim E, aztán reakciók bevételt hozam termékek P Q

Ez a típusú reakció az úgynevezett szekvenciális vagy egyszerű-elmozdulás reakciók, amelyek további osztva következő csoportok.

rendezett szubsztrát kötés vagy rendezett szekvenciális mechanizmus – ebben a típusban egy hordozónak kötődnie kell egy második szubsztrátum előtt.

ez a reakció a szubsztrátok egymást követő kötődését, valamint a termék szekvenciális felszabadulását jelzi. Ez a fajta mechanizmus figyelhető meg a NAD+ – t és laktátot tartalmazó Laktát-dehidrogénekkel katalizált reakciókban.

8.7.2. Véletlenszerű szubsztrátkötés – ebben a típusban vagy az A vagy B kötődhet először az enzimhez, majd a másik szubsztráthoz és a termék felszabadulásához.

This type of mechanism is observed in reactions catalyzed by transferases enzyme as hexokinase catalyzed phosphorylation of glucose by ATP.

8.7.3. Theorell-Chance Sequential mechanism

It is a type of ordered sequential bisubstrate reaction in which the ternary complex does not accumulate.

8.7.4. Ping-pong mechanizmus

a másik lehetőség a bi-szubsztrát reakcióban az, hogy egy szubsztrát, A, kötődik az enzimhez, és reakció közben egy termék, P szabadul fel, és az enzim átalakul módosított formává, E’. A második szubsztrát, A B, a módosított enzimmel jön be és kötődik a második termékhez, Q és regenerálja az enzimet, E.

a fenti mechanizmust követő reakciókat Ping-Pong vagy kettős elmozdulású reakcióknak nevezzük. Ez a fajta mechanizmus az aminotranszferázok által katalizált reakciókban figyelhető meg.

ezek az enzimek katalizálják egy aminosav-csoport átvitelét egy aminosavról egy α-keto-savra.A képződött termékek egy új aminosav, amely megfelel a keto-savnak és egy új keto-savnak, amely megfelel az aminosav szénvázának, például:-

A ping – pong reakció másik példája a foszfoglikerát mutáz. Az enzim egy szubsztrátumból foszfátot kap, majd az enzim foszforilációja után a foszfát átkerül a második szubsztrátumba.