Kontrollkísérleteket végeztek annak megerősítésére, hogy a kataláz a HSV-1-gyel társult, és nem a víruskészítményben jelen lévő szennyeződésekkel. A tisztított HSV-1-et szacharózsűrűség-gradienssel egy sávba centrifugáltuk, a gradienst frakcionáltuk, a nyugati blot analízist pedig az egyes gradiensfrakciók kataláz jelenlétének vizsgálatára használtuk. Az eredmények azt mutatták, hogy a kataláz vírus tartalmú frakciókban volt jelen, de nem egymás mellett (ábra. 1c). Az eredményeket úgy értelmezik, hogy azt jelzik, hogy a kataláz a HSV-1-hez kapcsolódik, nem pedig szennyező anyagokkal, például kataláz tartalmú baktériumokkal vagy gazdasejtekkel a víruskészítményben. Mivel a HSV-1 genom nem kódolja a katalázt (22), a vírushoz kapcsolódó enzimet a gazdasejtből kell származtatni. A vaccinia vírus korai vizsgálata kimutatta a kataláz jelenlétét az érett virionon belsejében (8). Ezen megfigyelés mellett nem tudunk más katalázról, mint egy vírusszerkezet összetevőjéről.

a HSV-1-hez társuló kataláz további analízise az enzim virionban való elhelyezkedésének meghatározására irányult. Kétféle kísérletet végeztek. Először a tisztított vírust proteolitikus pronáz enzimmel kezelték a vírus glikoproteinek és a virion membránban nem található fehérjék lebontására. A belső vírusfehérjéket várhatóan nem érinti, mivel a pronáz nem lép át a vírus lipid kétrétegén (16). A pronáz kezelés után a vírust centrifugálással gyűjtötték be, és a katalázveszteség mértékét Western blot analízissel határozták meg. Az eredmények nem mutattak katalázvesztést két vizsgált víruskoncentrációban (lásd a kataláz sávot az ábrán. 2a, 1. és 2. sáv). A belső kontrollok azt mutatták, hogy a vírus felszíni glikoproteinjei gB és gH a várt módon hasadtak (ábra. 2A; hasonlítsa össze a 2. és 3. sávot). Hasonlóképpen, a Western blot analízis kimutatta, hogy a HSV-1 glikoprotein D-t pronáz vagy tripszin emésztette olyan körülmények között, amelyekben a kataláz nem volt hatással (ábra. 2b). Az oldatban lévő tisztított katalázt ugyanolyan körülmények között emésztettük. Ezzel szemben a belső tegument (UL47, UL48 és UL49) vagy a kapszidfehérjék (UL19, UL38, UL18; ábra. 2a, 1.és 2. sáv) megfigyelték. Az eredményeket úgy értelmezik, hogy jelezzék, hogy a kataláz a HSV-1 borítékban található.

a kataláz lokalizációja a HSV-1-ben pronáz (1-3 sáv) és Triton X-100 (a, 4.és 5. sáv) tisztított virionok pronáz és tripszin kezeléssel (b, 1-3. sáv). Az A. Panel a pronáz (1.és 2. sáv) és a Triton X-100 (5. sáv) kezelés után az ép HSV-1-ben (3. és 4. sáv), valamint a virionokban lévő fehérjék SDS-PAGE és Western blot elemzését mutatja. Vegye figyelembe, hogy a kataláz az 1%-os Triton X-100 (5.sáv) kezelést követően ép virionokban (3. és 4. sáv) és pronázzal kezelt virionokban (1. és 2. sáv), de virionokban nem volt jelen. A pronáz-kezelést a tisztított HSV-1 (0,25 mg/ml) 1 mg/ml pronázzal (Streptomyces griseus; Calbiochem 537088) történő emésztésével végezték 4 órán át 37°C-on.a pronáz-kezelés után a vírust szacharózsűrűség-gradiens centrifugálással újraizálták az SDS-PAGE és a Western blot-elemzés előtt. A Triton X-100 kezelést úgy végezték, hogy a tisztított vírust 1% – os Triton X-100-ra igazították 10 mM ditiotreitolt (DTT) tartalmazó TNE pufferben, és 15 percig inkubálták jégen (4°c). A kapott kapszidokat ezután szacharóz gradiens centrifugálással tisztítottuk meg az SDS-PAGE és a Western blot analízis előtt. B) A tisztított HSV-1 Western blot analízise pronázzal vagy tripszinnel végzett in vitro kezelés után. Összesen 100 µl tisztított HSV-1-et (1 mg/ml) állítottunk be 2 mg/ml pronázra vagy 2 mg/ml tripszinre. A kontroll inkubációban nem volt enzim. Keverékek voltak keltetett 2 h 37°C-on, majd virions volt tisztított távol enzimek által centrifugálás egy 20% – os 50% – os szacharóz gradiens leírt legenda Ábra. 1. A vírus példányait centrifugálással szűrték le, majd SDS-PAGE és Western blot analízissel vizsgálták. Blotokat festettek katalázra (nyúl poliklonális; lásd fent) és a D glikoprotein (egér monoklonális antitest DL11; Gary Cohen és Roselyn Eisenberg ajándéka; 1:5000). Megjegyezzük, hogy a proteáz kezelés okozta emésztését glikoprotein D, DE nem kataláz, jelezve, hogy a kataláz belsejében található a HSV-1 membrán.

a kataláz helyének pontosabb meghatározását a tisztított vírus Triton X-100 (TX-100) nemionos mosószerrel történő kezelésével nyerték. Ha friss vírussal végezzük, ez a kezelés a vírusmembrán, a membrán glikoproteinek, valamint szinte az összes 20 vagy több tegument fehérje (az UL36, UL37 és US3 kivételével) (13, 21, 27) elvesztését okozza. A kapszid azonban megőrzi integritását, és egyik fő kapszidfehérje sem vész el. A vírus DNS megmarad a kapszid belsejében. A kísérletek során a HSV-1-et 1% TX-100-mal kezelték, és a kapott kapszidokat szacharózsűrűség-gradiens centrifugálással izolálták. A nyugati blot analízist ezután a kapszulák kataláz jelenlétének tesztelésére használták. Az eredmények azt mutatták, hogy a vírus glikoproteinjeit és tegument fehérjéit a várt módon eltávolították, és a katalázt is eltávolították (Lásd az 1.ábrát. 2a, 4. és 5. sáv). Ezt a kísérletet úgy értelmezik, hogy jelezze, hogy a kataláz jelen van a HSV-1 tegumentben.

információk, mint például az ábrán látható. 2 használható a HSV-1 viriononkénti katalázmolekulák számának meghatározására (15). Ezt a mérést a tisztított vírus két azonos aliquotjával kezdve végezték. A kettőt egy Coomassie kékfestésű gélből származó fő kapszid-fehérjemolekulák (UL19) számának meghatározására és (ii) egy kalibrált nyugati blotból származó 60 kDa-katalázmolekulák számának meghatározására használták. Egy reprezentatív meghatározásban ez az elemzés 1:207,5 értéket adott a kataláz moláris arányához az UL19-hez. Mivel HSV-1 kapszidonként 955 UL19 molekula van, a kapsidonkénti katalázmolekulák számát 955/207, 5 vagy 4.6-nak határoztuk meg. Egy második hasonló meghatározás 7,1 katalázmolekulát eredményezett. Mivel egy aktív kataláz molekulában (11, 20) négy 60 kDa alegység van, az eredmények 1-2 kataláz-tetramer jelenlétét jelzik viriononként.

a HSV-1 virion belsejében lévő kataláz jelenléte azt sugallja, hogy a vírus H2O2 általi oxidatív károsodástól való védelmében részt vehet. Alternatív megoldásként a kataláz passzív módon beépíthető a HSV-1-be, mivel a tegument hozzáadódik a gazdasejt citoplazmájába, és nincs védő funkciója. A két lehetőség megkülönböztetése érdekében megvizsgáltuk a tisztított HSV-1 érzékenységét inaktiválással h2o2in vitro. A HSV-1-et H2O2-vel kezelték nátrium-azid (NaN3) kataláz inhibitor jelenlétében vagy hiányában, majd ezt követően meghatározták a vírus titert (kataláz inhibitor hiányában). Az eredmények azt mutatták, hogy míg az 50 mM – es H2O2 a titer (3-4-szeres) mérsékelt csökkenését eredményezte, a nan3 jelenléte esetén 106-szoros vagy annál nagyobb halálos hatást figyeltek meg (1.táblázat). A kontrollkísérletek csak a NaN3 által a HSV-1 kis megölését mutatták (1. táblázat). Az eredményeket úgy értelmezik, hogy jelezze, hogy a kataláz jelentős szintű védelmet nyújt a HSV-1 inaktiválásával szemben H2O2.

nem várható, hogy a HSV-1-et meg kell védeni a H2O2 oxidatív károsodásától, miközben egy gazdasejthez kapcsolódik. Mint fentebb leírtuk, egy redukáló környezet található a sejten belül, amely megakadályozná a H2O2 képződését. A gazdasejten kívül azonban a környezet oxidáló, amely képes H2O2 előállítására mind a víruson belül, mind a környező közegben. A HSV-1 ezzel a környezettel találkozna, mivel az egyik gazdatestről a másikra terjed, és a kataláz részt vehet a HSV-1 fertőzőképességének védelmében a szállítás során. A HSV-1-hez kapcsolódó kataláz védelmet nyújthat a commensal baktériumok vagy más források által termelt H2O2 ellen is. A lactobacillusok által termelt H2O2 például bizonyítottan védi a női nemi szerveket a mikrobiális fertőzés okozta betegségektől (4). Magas katalitikus sebessége miatt a vírushoz kapcsolódó kataláz szerepe lehet a HSV-1 védelmében, annak alacsony példányszáma ellenére (viriononként 1-2 példány). A májkataláz például másodpercenként több tízmillió H2O2 molekulát képes méregteleníteni, a legmagasabb katalitikus sebesség között, amelyet bármely enzim esetében jelentettek (2).

a herpes család összes vírusának van egy tegumentje, egy fehérje rétege, amely a vírus kapszidja és a membrán között helyezkedik el (5, 6, 9, 13). A HSV-1 tegument vastagsága 40-50 nm, és körülbelül 20 különböző fehérjefajból áll, amelyek szinte mindegyike a vírus genomjában van kódolva. A Tegument fehérjék bőségükben lényegesen különböznek a virionban, legalább 800 példányban, mint például az UL47, az UL48 és az UL49 (Lásd az ábrát. 2a, 3.út) (5., 16.). Számos tegument fehérje vesz részt a HSV-1 replikáció korai szakaszában, mint például a korai gén transzkripció aktiválása és a gazdasejt fehérjeszintézisének csillapítása (13, 24, 25). A tegument a születő HSV-1 virionba, mint DNS-tartalmú kapszidot, a trans-Golgi hálózat vezikulumába (10) szerelik össze. Javasolt, hogy a kataláz a bimbózó folyamat során más tegument fehérjékkel együtt kerüljön beépítésre.

a nem fertőzött sejtekben a legtöbb kataláz peroxiszómákban (26) található. Annak érdekében, hogy a fent leírtak szerint a tegumentáció során beépüljön az utódokba a HSV-1, A katalázt ki kell szabadítani a peroxiszómákból. Javasoljuk, hogy ez a HSV-1 replikációt kísérő citoplazmatikus membránok nagyszabású átrendeződésének következménye lehet (1).

Palamara et al. (19) kimutatták, hogy a citoplazmatikus glutation koncentráció csökkenése azonnal megtörténik, miután a Vero sejteket HSV-1-vel fertőzték meg. A glutationkoncentráció csökkenése várhatóan a citoszol redukáló potenciál csökkenését okozza, és ez a csökkenés a HSV-1 replikációját fokozza. A növekedési közegben biztosított Extra glutationról megállapították, hogy antagonizálja a HSV-1 növekedést (19). A külsőleg hozzáadott glutationhoz hasonlóan a citoszolos kataláz a H2O2 eltávolításával növelheti a citoplazma redukáló potenciálját. Ezért javasolt, hogy a kataláz beépülésének egyik következménye az utódok virionjaiba a vírus növekedésének fokozása lehet a fertőzött sejtek kataláztól való megfosztásával.

a viriononkénti katalázmolekulák kis száma magyarázhatja, hogy miért nem mutatták ki a teljes HSV-1 virionok (7) tömegspektrometriás analízisében. Számos nagy példányszámú HSV-1 virion protein található, amelyek elhomályosíthatják a kataláz jelét (például több ezer példányban vannak glikoprotein molekulák és 955 példányban a fő kapszid fehérje). A kataláz bősége nem felel meg a tömegspektrometriás kimutatási informális szabványnak (láthatóság egy Coomassie-festett SDS-oldal gélen). A HSV-1 (7, 26) tömegspektrometriás analízisében kimutatták a peroxiredoxint, egy antioxidáns hatású peroxiszomális fehérjét.

a jövőben lehetséges lehet a HSV-1 érzékenysége a H2O2 citotoxikus hatásaira. Várható, hogy a vírus különösen sérülékeny lesz, ha oxidáló környezetben van a gazdasejten kívül, és ha a kataláz gátolva van.