tekst

virussen ervaren heel verschillende omgevingen, afhankelijk van of ze zich in een gastheercel vermenigvuldigen of van de ene gastheer naar de andere gaan. In een cel worden het virus en de viruscomponenten blootgesteld aan een redoxpotentiaal dat voornamelijk door glutathion wordt bepaald (18). In tegenstelling, buiten een cel, wordt het virus blootgesteld aan zuurstof en giftige producten afgeleid van zuurstof, zoals waterstofperoxide, superoxide, en hydroxylradicale, reactieve species die het potentieel hebben om het virus te inactiveren. Om dergelijke sterk reactieve verbindingen het hoofd te bieden, drukken planten en dieren enzymen uit die ze kunnen omzetten in niet-toxische producten. Voorbeelden van dergelijke enzymen zijn catalase, peroxidasen en superoxide dismutase (28). Hier beschrijven we de resultaten van studies die de aanwezigheid van catalase in de gezuiverde herpes simplex virion aantonen. Vervolgens werden Tests uitgevoerd om te bepalen of interne catalase het virus kon beschermen tegen inactivatie door H2O2.

studies met catalase werden uitgevoerd met herpes simplex virus 1 (HSV-1) dat werd gekweekt op verocellen in cultuur en gezuiverd door sucrose density gradiënt centrifugatie. Toen virussuspensies werden aangepast tot 1% H2O2, begonnen zich onmiddellijk belletjes zuurstof te vormen, wat de aanwezigheid van catalase aangaf (Fig. 1a, linkerbuis). Bubbels werden zichtbaar na een paar seconden incubatie bij kamertemperatuur en bleven zich ten minste 20 minuten vormen en vergroten. Er werden echter geen belletjes gevormd als de catalaseremmer natriumazide vóór de H2O2-behandeling aan de virussuspensie werd toegevoegd (Fig. 1a, rechts). De tests waren ook negatief wanneer i) het virus uit de oplossing werd verwijderd door middel van centrifugering voorafgaand aan de toevoeging van H2O2 of ii) intact virus werd vervangen door HSV-1-capsiden (B-capsiden). Bij vergelijkbare tests werden geen bubbels waargenomen die wijzen op de aanwezigheid van catalase met gezuiverd vesiculair stomatitisvirus of humaan adenovirus 2 (gegevens niet getoond). Western blot analyse bevestigde de aanwezigheid van catalase geassocieerd met HSV-1 virus, maar niet met adenovirus, vesiculaire stomatitis virus (VSV), of HSV-1 A capsiden (Fig. 1 ter).

Identificatie van HSV-1-geassocieerde catalase door enzyme assay (a), Western blot analysis (b) en sucrose density gradient centrifugation (c). Paneel a toont een buis met gezuiverde HSV-1 20 min nadat de oplossing was ingesteld op 1% H2O2 (linkerbuis) en een soortgelijke incubatie waaraan een catalaseremmer (2 mM natriumazide) werd toegevoegd vóór H2O2 (rechts). Let op de vorming van bellen in de linkerbuis, wat wijst op de aanwezigheid van catalase in het virus. De virusconcentratie was 0,25 mg / ml in TNE (0,01 M Tris-HCl, 0,5 M NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) en de incubatie was bij kamertemperatuur. Het virus was de KOS-stam van HSV-1, die werd gekweekt op monolaagculturen van Verocellen en werd gezuiverd door middel van sucrose-dichtheid-gradiëntcentrifugatie, en de titer werd bepaald door eindpuntverdunning zoals eerder beschreven (14). Panel b toont de resultaten van een Western blot test voor de aanwezigheid van catalase in HSV-1, humaan adenovirus 2 (HAd2), vesiculaire stomatitis virus (VSV), en HSV-1 A capsiden. Humaan adenovirus 2 en vesiculaire stomatitis virus (Indiana; San Juan stam) werden gekweekt op monolaag culturen van respectievelijk HeLa en Vero cellen, en gezuiverd door eerder beschreven procedures (12, 17). Gepubliceerde methoden werden ook gebruikt voor de zuivering van HSV-1 A en B capsiden (23). Belangrijke capside-eiwitten werden gedetecteerd door de vlek te kleuren met 1% Ponceau S (Bovenste rij), terwijl catalase werd gedetecteerd door immunokleuring met antilichaam specifiek voor catalase (Calbiochem; polyclonal konijn 219010; 1:5.000 verdunning) (15). Merk op dat catalase werd gedetecteerd in HSV-1 virus, maar niet had2, VSV, of HSV-1 A capsides. Panel c toont de resultaten van sucrose dichtheid gradiënt analyse. Een totaal van 50 µg gezuiverd HSV-1 in 50 µl TNE werd gecentrifugeerd op een 600-µl gradiënt van 20% tot 50% sucrose in TNE. Centrifugeren duurde 45 minuten bij 22.000 toeren per minuut in een Beckman SW55-rotor bij 4°C. De gradiënt werd gefractioneerd, en individuele fracties werden geanalyseerd door SDS-PAGE gevolgd door blotting op polyvinylideendifluoride (PVDF) en kleuring met 1% Ponceau S. de vlek werd vervolgens verwijderd en gekleurd met antistoffen specifiek voor catalase (die toevallig migreerde met standaard catalase; Worthington LS001872). Merk op dat de positie van het virus in de gradiënt (bovenste rij) samenvalt met die van catalase (onderste rij), wat suggereert dat de twee zijn geassocieerd.

controle-experimenten werden uitgevoerd om te bevestigen dat catalase in verband werd gebracht met HSV-1 en niet met verontreinigingen in het viruspreparaat. Gezuiverde HSV-1 werd gecentrifugeerd in een band op een sucrose dichtheid gradiënt, de gradiënt werd gefractioneerd, en Western blot analyse werd gebruikt om individuele gradiënt fracties voor de aanwezigheid van catalase te testen. De resultaten toonden aan dat catalase aanwezig was in virusbevattende fracties, maar niet in flankerende (Fig. 1c). De resultaten worden geïnterpreteerd om aan te geven dat catalase geassocieerd is met HSV-1 en niet met contaminanten, zoals catalase-bevattende bacteriën of gastcelmaterialen in het viruspreparaat. Aangezien het HSV-1-genoom geen catalase codeert (22), moet het met het virus geassocieerde enzym worden afgeleid van de gastheercel. Vroege studies met vacciniavirus toonden de aanwezigheid van catalase in het volwassen virion aan (8). Afgezien van deze observatie, kennen we geen ander rapport van catalase als onderdeel van een virusstructuur.

verdere analyse van HSV-1-geassocieerde catalase was gericht op het bepalen van de locatie van het enzym in het virion. Er werden twee soorten experimenten uitgevoerd. Eerst werd gezuiverd virus behandeld met het proteolytische enzym pronase om de virusglycoproteïnen en alle eiwitten die niet in het virion-membraan zitten, af te breken. De interne viruseiwitten zouden naar verwachting niet worden beïnvloed, aangezien pronase niet de tweelaag van het viruslipide passeert (16). Na behandeling met pronase, werd het virus geoogst door centrifugeren, en de mate van catalase verlies werd bepaald door Western blot analyse. De resultaten toonden geen bewijs van catalaseverlies in twee geteste virusconcentraties (zie de catalaseband in Fig. 2a, rijstroken 1 en 2). Interne controles toonden aan dat de virusoppervlakteglycoproteïnen gB en gH gekloofd waren zoals verwacht (Fig. 2a; vergelijk rijstroken 2 en 3). Ook Western blot analyse toonde aan dat HSV-1 glycoproteïne D werd verteerd door pronase of trypsine onder omstandigheden waarin catalase niet werd beïnvloed (Fig. 2b). Gezuiverde catalase in oplossing werd ook onder dezelfde omstandigheden verteerd. In tegenstelling, geen degradatie van intern doppen (UL47, UL48, en UL49) of capside proteã nen (UL19, UL38, UL18; Fig. 2a, rijstroken 1 en 2) werd waargenomen. De resultaten worden geïnterpreteerd om aan te geven dat catalase zich in de HSV-1 envelop bevindt.

lokalisatie van catalase in HSV-1 door behandeling van gezuiverde virionen met pronase (rijstroken 1 tot 3) en Triton X-100 (a, rijstroken 4 en 5) en door behandeling met pronase en trypsine (B, rijstroken 1 tot 3). Paneel a toont SDS-pagina en Western blot analyse van eiwitten aanwezig in intacte HSV-1 (rijstroken 3 en 4) en in virionen na behandeling met pronase (rijstroken 1 en 2) en Triton X-100 (rijstrook 5). Merk op dat catalase aanwezig bleek te zijn in intacte virionen (rijstroken 3 en 4) en in met pronase behandelde virionen (rijstroken 1 en 2) maar niet in virionen na behandeling met 1% Triton X-100 (rijstrook 5). Pronase behandeling werd uitgevoerd door het verteren van gezuiverde HSV-1 (0,25 mg/ml) met 1 mg/ml pronase (Streptomyces griseus; Calbiochem 537088) voor 4 h bij 37°C. Na pronase behandeling, werd het virus gereisolated door sucrose dichtheid gradiënt centrifugatie voorafgaand aan SDS-PAGE en Western blot analyse. De behandeling met Triton X-100 werd uitgevoerd door het gezuiverde virus aan te passen aan 1% Triton X-100 in TNE-buffer met 10 mM dithiothreitol (DTT) en gedurende 15 minuten op ijs (4°C) te incuberen. De resulterende capsiden werden vervolgens gezuiverd door sucrose gradiënt centrifugatie vóór SDS-PAGE en Western blot analyse. (B) Western blot analyse van gezuiverde HSV-1 na behandeling in vitro met pronase of trypsine. Een totaal van 100 µl gezuiverd HSV-1 (1 mg/ml) werd aangepast tot 2 mg/ml pronase of 2 mg/ml trypsine. Een controle incubatie had geen enzym. Mengsels werden gedurende 2 uur bij 37°C geïncubeerd en virionen werden gezuiverd van enzymen door centrifugering op een 20% tot 50% sucrose gradiënt zoals beschreven in de legende tot Fig. 1. Virusspecimens werden gepelleteerd door middel van centrifugering en onderzocht door middel van SDS-PAGE-en Western blot-analyse. Vlekken werden gekleurd voor catalase (konijn polyclonal; zie hierboven) en glycoproteïne D (muis monoklonaal antilichaam DL11; een geschenk van Gary Cohen en Roselyn Eisenberg; 1:5.000). Merk op dat protease behandeling de spijsvertering van glycoproteïne d veroorzaakte, maar niet catalase, wat aangeeft dat catalase zich in het HSV-1 membraan bevindt.

een nauwkeuriger definitie voor de locatie van catalase werd verkregen door behandeling van gezuiverd virus met het nietionische detergens Triton X-100 (TX-100). Wanneer uitgevoerd met vers virus, veroorzaakt deze behandeling verlies van het virusmembraan, de membraanglycoproteïnen, en bijna alle 20 of meer doppeneiwitten (alle behalve UL36, UL37 en US3) (13, 21, 27). Capsid behoudt zijn integriteit, echter, en geen van de belangrijkste capsid proteã nen worden verloren. Het virusdna wordt in de capside behouden. Experimenten betroffen de behandeling van HSV-1 met 1% TX-100 en de isolatie van de resulterende capsiden door sucrose density gradiënt centrifugatie. De westelijke vlekanalyse werd toen gebruikt om capsides voor de aanwezigheid van catalase te testen. De resultaten toonden aan dat de virusglycoproteïnen en doppeneiwitten zoals verwacht werden verwijderd en dat ook catalase werd verwijderd (zie Fig. 2a, rijstroken 4 en 5). Dit experiment wordt geïnterpreteerd om aan te geven dat catalase aanwezig is in het HSV-1 tegument.

informatie zoals weergegeven in Fig. 2 kan worden gebruikt om het aantal catalasemoleculen per HSV-1 virion te bepalen (15). Deze meting werd uitgevoerd te beginnen met twee identieke aliquots gezuiverd virus. De twee werden gebruikt voor de bepaling van (i) het aantal belangrijke capside eiwitmoleculen (UL19) uit een coomassie blauw-gebeitste gel en (ii) het aantal 60-kDa catalase moleculen uit een gekalibreerde Western blot. In een representatieve bepaling leverde deze analyse een waarde op van 1:207,5 voor de molaire verhouding van catalase tot UL19. Aangezien er 955 UL19 molecules per HSV-1 capside zijn, werd het aantal catalasemolecules per capside bepaald om 955/207.5 of 4.6 te zijn. Een tweede vergelijkbare bepaling leverde een waarde op van 7.1 catalasemoleculen. Aangezien er vier 60-kDa subeenheden in een actieve catalasemolecule (11, 20) zijn, wijzen de resultaten op de aanwezigheid van 1 tot 2 catalasetramers per virion.

de aanwezigheid van catalase in het HSV-1 virion suggereert de mogelijkheid dat het betrokken is bij de bescherming van het virus tegen oxidatieve schade door H2O2. Als alternatief, kan catalase passief in HSV-1 worden opgenomen aangezien het tegument in het cytoplasma van de gastheercel wordt toegevoegd en geen beschermende functie heeft. Om onderscheid te maken tussen de twee mogelijkheden, onderzochten we de gevoeligheid van gezuiverd HSV-1 Voor inactivatie door h2o2in vitro. HSV-1 werd behandeld met H2O2 in aanwezigheid of afwezigheid van de catalaseremmer natriumazide (NaN3), en de virustiter werd daarna bepaald (in afwezigheid van catalaseremmer). Uit de resultaten bleek dat terwijl 50 mM H2O2 een bescheiden afname van de titer veroorzaakte (3 tot 4 maal), een letaal effect van 106 maal of meer werd waargenomen als NaN3 aanwezig was (Tabel 1). Controle-experimenten toonden weinig doden van HSV-1 door NaN3 alleen (Tabel 1). De resultaten worden geïnterpreteerd om aan te geven dat catalase een significant niveau van bescherming biedt tegen inactivering van HSV-1 door H2O2.

Het is niet te verwachten dat HSV-1 beschermd moet worden tegen oxidatieve schade door H2O2 terwijl het geassocieerd is met een gastcel. Zoals hierboven beschreven, wordt een verminderend milieu gevonden binnen de cel, en dat zou vorming van H2O2 verhinderen. Buiten de gastheercel, echter, is het milieu oxiderende één, bekwaam om H2O2 zowel binnen het virus als in het omringende medium te produceren. HSV-1 zou deze omgeving tegenkomen als het van de ene gastheer naar de andere wordt overgebracht, en catalase kan betrokken zijn bij de bescherming van HSV-1 infectiviteit tijdens de doorvoer. HSV-1-geassocieerde catalase kan ook bescherming bieden tegen H2O2 geproduceerd door commensale bacteriën of andere bronnen. H2O2 geproduceerd door lactobacilli, bijvoorbeeld, is aangetoond dat het de vrouwelijke geslachtsorganen beschermt tegen ziekten als gevolg van microbiële infectie (4). Vanwege de hoge katalytische snelheid kan virusgeassocieerde catalase een rol spelen bij de bescherming van HSV-1 ondanks het lage aantal kopieën (1 tot 2 kopieën per virion). Leverkatalase, bijvoorbeeld, is in staat om tientallen miljoenen H2O2 moleculen per seconde te ontgiften, een van de hoogste katalytische tarieven gerapporteerd voor om het even welk enzym (2).

alle virussen in de herpes familie hebben een doppen, een laag eiwit dat tussen de kapside van het virus en het membraan ligt (5, 6, 9, 13). Het HSV-1-tegument is 40 tot 50 nm dik en bestaat uit ongeveer 20 verschillende eiwitsoorten, die bijna allemaal gecodeerd zijn in het virusgenoom. De proteã nen van het Tegument verschillen wezenlijk in hun overvloed in virion met 800 exemplaren of meer van de belangrijkste species, zoals UL47, UL48, en UL49 (zie Fig. 2a, rijstrook 3) (5, 16). Veel doppeneiwitten zijn betrokken bij vroege stappen van HSV-1 replicatie, zoals activering van vroege gentranscriptie en verzwakking van de eiwitsynthese van de gastheercel (13, 24, 25). Het mement wordt geassembleerd in de ontluikende HSV-1 virion als een DNA-bevattende capside knoppen in een blaasje van het trans-Golgi netwerk (10). Men stelt voor dat catalase samen met andere doppenproteã nen tijdens het ontluikende proces wordt opgenomen.

in niet-geïnfecteerde cellen wordt de meeste catalase aangetroffen in peroxisomen (26). Om het tijdens de tegumentatie zoals hierboven beschreven in het nageslacht HSV-1 te kunnen verwerken, moet catalase uit peroxisomen vrijkomen. Wij stellen voor dat dit kan gebeuren als gevolg van de grootschalige herschikking van cytoplasmatische membranen die gepaard gaat met HSV-1 replicatie (1).

Palamara et al. (19) hebben aangetoond dat een afname van de cytoplasmatische glutathionconcentratie onmiddellijk optreedt nadat Verocellen zijn geïnfecteerd met HSV-1. Een afname van de glutathionconcentratie zal naar verwachting leiden tot een afname van het cytosolisch reductiepotentieel, en deze afname lijkt de HSV-1-replicatie te versterken. Extra glutathion in het groeimedium bleek de HSV-1 groei tegen te werken (19). Als extern toegevoegde glutathione, kan cytosolic catalase het verminderende potentieel van het cytoplasma verhogen door H2O2 te verwijderen. Daarom wordt gesuggereerd dat een gevolg van de incorporatie van catalase in nieuwe virionen kan zijn dat de virusgroei wordt versterkt doordat geïnfecteerde cellen geen catalase meer krijgen.

het kleine aantal catalasemoleculen per virion kan verklaren waarom het niet werd gedetecteerd in een massaspectrometrische analyse van hele HSV-1 virionen (7). Er zijn verscheidene hoog-exemplaar-aantal HSV-1 virionproteã nen die signaal van catalase konden verduisteren (bijvoorbeeld, zijn er duizenden exemplaren van glycoproteã nemolecules en 955 exemplaren van de belangrijkste capsideproteã ne ). De abundantie van catalase voldoet niet aan de informele norm voor detectie door massaspectrometrie (zichtbaarheid op een coomassie-gekleurde SDS-pagina gel). Peroxiredoxine, een peroxisomaal eiwit met antioxiderende activiteit, werd gedetecteerd in de massaspectrometrische analyse van HSV-1 (7, 26).

In de toekomst kan de gevoeligheid van HSV-1 voor de cytotoxische effecten van H2O2 worden benut. Verwacht wordt dat het virus bijzonder kwetsbaar is wanneer het zich in een oxiderende omgeving buiten de gastheercel bevindt en wanneer catalase wordt geremd.