zwyrodnienie krążka jest częstym schorzeniem o złożonej etiologii wieloczynnikowej. 1 jako przyczynę degeneracji dysku z trądzikiem Propionibacterium zaproponowano infekcję niskiego stopnia zidentyfikowaną u 84% pacjentów z przepukliną dysku i rwą kulszową za pomocą serologii i hodowli. 2 zaobserwowano również zmiany molekularne, takie jak zwiększona produkcja enzymów katabolicznych (katepsyny, lizozymu i kilku metaloproteinaz matrycowych) i cytokin zapalnych. U 3 młodych pacjentów z przepukliną dysku lędźwiowego stwierdzono słabszą regenerację po operacji, gdy przed operacją stwierdzono podwyższone stężenia białka C-reaktywnego o wysokiej czułości (hs-CRP) w surowicy. Nie jest jednak jasne, czy wysokie poziomy CRP i cytokin zapalnych wskazują na miejscowe zakażenie lub odpowiedź zapalną na przepuklinę dysku. 4

patogeny, takie jak wirus Parvo B19 lub wirus Epsteina-Barr (EBV), odgrywają ważną rolę w patogenezie różnych form zapalenia stawów. 5,6 wirusów opryszczki to zróżnicowana rodzina dużych wirusów DNA, z których wszystkie mogą tworzyć utajone infekcje przez całe życie. Pierwotne zakażenie wieloma z tych wirusów jest powszechne w dzieciństwie. 7,8

badanie miało na celu zbadanie potencjalnej roli wirusów opryszczki, wirusa opryszczki pospolitej typu 1(HSV-1), wirusa opryszczki pospolitej typu 2 (HSV-2) i wirusa cytomegalii (CMV) w patogenezie zwyrodnienia krążka międzykręgowego. Analiza molekularna próbek krążków międzykręgowych uzyskanych podczas dyskektomii wykazała znaczną częstość występowania DNA CMV i HSV-1 w zdegenerowanych dyskach, co sugeruje, że infekcje wirusowe mogą być ważnym czynnikiem etiologicznym tej choroby.

pacjenci i metody

przebadano łącznie 16 kolejnych pacjentów, którzy przeszli dyskektomię w ciągu sześciu miesięcy od przepukliny dysku lędźwiowego. Było ośmiu mężczyzn i osiem kobiet w średnim wieku 40,38 lat (od 17 do 65 lat). Badanie miało aprobatę etyczną. Diagnoza przepukliny dysku lędźwiowego została ustalona na podstawie badania fizykalnego i MRI. Aby zapewnić grupę kontrolną, próbki dysków uzyskano przezskórnie od dwóch pacjentów z pęknięciami w odcinku piersiowo-lędźwiowym, którzy byli poddawani operacji. Pacjenci ci poddawani byli również przedoperacyjnemu badaniu MRI w celu wykluczenia współistniejącej degeneracji. Charakter próbek badanych w tym badaniu nie pozwolił na włączenie większej liczby krążków międzykręgowych od zdrowych osób ze względów etycznych, podczas gdy alternatywa próbek zwłok jako kontroli została porzucona, ponieważ większość dorosłej populacji ma historię bólu krzyża i degeneracji dysku.

oprócz materiału z przepukliny dysku uzyskanego podczas dyskektomii pobrano od każdego pacjenta próbkę krwi obwodowej. Próbki tkanek umieszczono w sterylizowanym polipropylenie 1.Probówki o pojemności 5 ml i przechowywane w temperaturze -80°C do czasu przeprowadzenia ekstrakcji DNA/RNA i reakcji łańcuchowej polimerazy/ ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR/qRT-PCR). Wykrywanie przeciwciał HSV-1 i CMV, IgM+ i IgG+ z osocza przeprowadzono przy użyciu standardowego enzymatycznego testu immunologicznego.

ekstrakcja DNA/RNA.

genomowe DNA i całkowity RNA ekstrahowano z próbek tkanek przy użyciu zestawu Nucleospin Tissue XS kit i zestawu NucleoSpin RNA XS (Macherey-Nagel GmbH and Co., Düren, Niemcy), odpowiednio, zgodnie z instrukcją producenta. Oczyszczony RNA poddano dalszej obróbce DNaseI, aby uniknąć zanieczyszczenia DNA. Stężenia próbek DNA i RNA oznaczano za pomocą spektrofotometru (260 nm) przed amplifikacją PCR lub qRT-PCR.

wykrywanie DNA wirusów opryszczki.

przetestowaliśmy osiem różnych wirusów opryszczki (HSV-1/-2, wirus półpaśca (VZV), EBV, CMV, wirusy opryszczki 6, 7 i 8 (HHV6, HHV7 i HHV8)) przy użyciu testu RhyMA-Herpes Screening zgodnie z instrukcjami producenta (Euroclone, Pawia, Włochy). Test RhyMA oparto na technologii odwrotnej hybrydyzacji, polegającej na amplifikacji multiplex DNA metodą PCR ze specyficznymi biotynylowanymi starterami, a następnie hybrydyzacji amplifikowanych i biotynylowanych fragmentów DNA z paskami na sondach, specyficznymi dla każdego wirusa opryszczki. Do oceny wyników wymagana była końcowa reakcja z zastosowaniem układu biotyna-streptawidyna. W każdym pasku znalazły się również regulatory dodatnie i wzmacniające. W celu interpretacji wyników, opracowany Pasek każdej próbki został dopasowany do standardowej tabeli. Test RhyMA-Herpes Screening jest dopuszczony do stosowania w diagnostyce in vitro, co potwierdza wysoką swoistość i czułość testu. W celu zweryfikowania wyników uzyskanych przy użyciu testu RhyMA-testu przesiewowego opryszczki, produkty PCR przeprowadzono również w 3% niskotopliwym żelu agarozowym, wytwarzając oczekiwany wzór elektroforetyczny dla każdego wirusa. Ostatecznie próbki PCR-dodatnie poddano bezpośredniej analizie sekwencyjnej, potwierdzając wyniki uzyskane przy użyciu testu RhyMA-Herpes screening assay.

HSV-1 i CMV qRT-PCR.

całkowite RNA zostało poddane odwrotnej transkrypcji przy użyciu RETRO-script kit (Ambion Inc., Austin, Teksas, USA) z przypadkowymi podkładami heksamerowymi. cDNA testowano pod kątem jakości szablonów poprzez konstruowanie standardowych krzywych przy użyciu szeregowych rozcieńczeń każdego cDNA jako szablonów w qRT-PCRs. Szablony cDNA dawały skuteczność testu od 90% do 105%, a R2 wszystkich krzywych standardowych wynosił > 0,98. Po odwrotnej transkrypcji cDNA Amplifikowano przy użyciu starterów specyficznych dla ICP0 i IE1 do kwantyfikacji odpowiednio mRNA HSV – 1 i HCMV, jak opisano wcześniej. 9,10

wszystkie qRT-PCR zostały wykonane w trzech egzemplarzach przy użyciu Maxima SYBR Green qPCR master mix (Fermentas Inc., Glen Burnie, Maryland) w detektorze sekwencji ABI PRISM 7500 (PE Biosystems, Foster City, Kanada), W tym wyekstrahowane próbki RNA, a także kontrole pozytywne i negatywne. Fluorescencję SYBR Green mierzono w ciągu 40 cykli amplifikacji. Dla każdego szablonu obliczono średnią liczbę cyklu, przy której akumulacja produktu weszła w zakres liniowy (CT). Powtórzone wartości tomografii komputerowej mieściły się w granicach 0, 4 cykli. Wartość CT 18srna dla danego szablonu odejmowano od CT uzyskanego dla każdego interesującego mRNA (ICP0 i IE1) z tego samego szablonu, aby uzyskać znormalizowaną wartość CT (ΔCT) dla każdego szablonu.

czynnik martwicy nowotworów-ekspresja genu α i interleukiny-6.

do oznaczania ilościowego mRNA TNF-α lub IL-6 użyto 1 µl cDNA wraz z starterami przedstawionymi powyżej w reakcji 20 µl, stosując SYBR green jako marker zawartości DNA. Zastosowane startery to: beta actin: Forward: 5 ’- TCAGAAGAACCC CTA TGT GG-3′, Reverse: 5′-TCT CTT TGA TGT CAC GCA CG-3′; TNF-a Forward: 5′-CAC GCT CTT CTG TCT ACT GAA CTT CG-3′, Reverse: 5′-GGC TGG GTA GAG AAT GGA TGA ACA CC-3′, 11 IL-6: Forward: 5′-ACA GCC ACT CAC CTC TTC AG -3′, Reverse: 5′ – GTG CCT CTT TGC TGC TTT CAC -3′. 12 W reakcji nie było żadnych produktów ubocznych, na co wskazuje wzór dysocjacji podany na końcu reakcji i elektroforeza w żelu agarozowym (dane nie zostały przedstawione). Skuteczność amplifikacji produktów TNF-α i IL-6 była taka sama jak w przypadku beta-aktyny, na co wskazują standardowe krzywe amplifikacji, co pozwala nam użyć wzoru: zwiększenie krotności = 2 – (ΔCt A-ΔCtB). Reakcje przeprowadzono w trzech egzemplarzach, aby umożliwić ocenę statystyczną.

wyniki

zastosowano test hybrydyzacji odwrotnej metodą PCR do przesiewania DNA ośmiu różnych wirusów opryszczki w próbkach krążka międzykręgowego u pacjentów z przepukliną krążka (Fig. 1). DNA herpeswirusa wykryto u 13 z 16 osobników (81,25%). Najwyższą częstość występowania HSV-1 stwierdzono u dziewięciu pacjentów (56,25%), natomiast CMV wykryto u sześciu pacjentów (37,5%) (Tabela I). Dwóch pacjentów było jednocześnie zakażonych HSV-1 i CMV. DNA z HSV-2, VZV, EBV,HHV6, HHV7 i HHV8 nie zostało wykryte w próbkach dyskowych żadnego z pacjentów. U żadnego z pacjentów z grupy kontrolnej (C1 i C2) nie stwierdzono obecności DNA wirusa opryszczki (Fig. 1).

status zakażenia HSV-1 i CMV w próbkach krążka międzykręgowego zbadano, badając potencjalną ekspresję transkryptów wirusowych za pomocą QRT-PCR w czasie rzeczywistym. Ekspresja genu wirusa opryszczki nie została wykryta w żadnej z badanych próbek, co wskazuje na brak aktywnej infekcji wirusowej, sugerując tym samym ustanowienie utajonego zakażenia wirusem opryszczki u tych osobników.

zbadano również seropozytywność pacjentów. Wszyscy pacjenci z HSV-1 lub CMV z PCR wykazywali odpowiednio przeciwciała IgG + dla tego samego wirusa (Tabela I). W trzech przypadkach dla HSV – 1 i w sześciu przypadkach dla CMV wykryto przeciwciała IgG+ bez jednoczesnego występowania wirusowego DNA. Ponadto, przeciwciała HSV-1 i CMV IgM+ z krwi obwodowej były ujemne u wszystkich pacjentów, co wskazuje, że żaden z pacjentów nie doświadczył ostrego zakażenia wirusem opryszczki w czasie chirurgicznego wycięcia.

poza makroskopowym wskazaniem stanu zapalnego wokół przepukliny krążka, uzyskaliśmy również eksperymentalne dowody stanu zapalnego w próbkach krążka międzykręgowego, badając poziomy mRNA TNF-α i IL-6 we wszystkich próbkach z zastosowaniem qRT-PCR. Analiza wykazała około 2-3-krotny wzrost obu markerów zapalnych w próbkach w porównaniu z kontrolnymi (Fig. 2). Co ciekawe, pacjenci zakażeni jednocześnie HSV-1 i CMV wykazywali najwyższe poziomy TNF-α i IL-6. Ponadto u dwóch na trzech pacjentów (pacjentów 2 i 8) bez objawów zakażenia wirusowego stwierdzono niższe poziomy TNF-α. Tej ujemnej korelacji nie stwierdzono dla stężenia IL-6 u tych pacjentów.

dyskusja

niniejsze badanie sugeruje koncepcję, że zakażenie wirusem opryszczki może sprzyjać degeneracji dysku. Byliśmy w stanie wykryć DNA HSV-1 i CMV w dużej liczbie próbek ludzkiego krążka pobranych podczas dyskektomii.

jako możliwą przyczynę zwyrodnienia dysku sugerowano wcześniejsze infekcje o niskim stopniu zaawansowania. 2,4 kilku autorów podkreśliło zależność pomiędzy sygnałami Modic typu 1 (zwiększone natężenie sygnału szpiku w obrazach MR ważonych T2 i zmniejszone natężenie sygnału w obrazach MR ważonych T1 i tkance włóknisto-naczyniowej w płytkach końcowych) a zakażeniem. 13,14 jeśli u pacjentów nie występują silne bóle pleców, Temperatura lub nieprawidłowy profil krwi, trudno jest odróżnić zmiany Modic 1 od infekcji o niskim stopniu nasilenia. 13,14

związek między zakażeniem wirusowym a apoptozą został szeroko zbadany, wyjaśniając mechanizmy indukcji apoptozy przez wirusy. 15,16 obecnie wiadomo, że parwowirus B19, a zwłaszcza jego białko NS-1, ma silny wpływ cytotoksyczny na komórki gospodarza i powoduje apoptozę w zakażonych komórkach. Wirusy odgrywają rolę w patogenezie różnych form zapalenia stawów. Stahl i wsp. 5 wykryli wirusowe DNA z wielu wirusów w tkankach maziowych pobranych od pacjentów z wczesnym zapaleniem stawów. Ostatnie badania sugerują, że zaawansowane stadia choroby zwyrodnieniowej stawów mogą być związane ze zwiększonym stanem zapalnym i uszkodzeniem chrząstki stawowej z powodu parwowirusa B19. W innym badaniu zaproponowano, że ludzki parwowirus B19 bierze udział w inicjowaniu i utrwalaniu zapalenia błony maziowej w reumatoidalnym zapaleniu stawów, prowadząc do zmian w stawach w trakcie nadmiernej syntezy cytokin zapalnych i enzymów proteolitycznych.

zakażenia HSV-1 są endemiczne na całym świecie. Ponad 90% dorosłych ma przeciwciała przeciwko HSV-1 w piątej dekadzie. Wirusy opryszczki są wszechobecnymi patogenami u dzieci, pozostającymi utajonymi po aktywnej infekcji. 20,21 w początkowej fazie infekcji dochodzi do replikacji wirusa w zwojach z przetrwaniem niektórych komórek, które utrzymują genom wirusa zgodny z normalną funkcją komórkową. Ta dobra równowaga między komórkami gospodarza a wirusem może być zaburzona przez różne bodźce, prowadzące do reaktywacji.

w naszym badaniu żaden z pacjentów nie doświadczył ostrego zakażenia opryszczką. Było to widoczne zarówno na poziomie serologicznym, z powodu braku przeciwciał IgM+ z krwi obwodowej, jak i na poziomie molekularnym z powodu braku transkryptów wirusowego mRNA z próbek dyskowych. Tak więc, wysoka częstość występowania zakażenia HSV-1 w dzieciństwie, jak również jego zatrzymanie w układzie nerwowym, może zaoferować zadowalające wyjaśnienie obecności zarówno HSV-1 i CMV w krążku międzykręgowym.

powstaje pytanie, w jaki sposób wirusy wchodzą do przestrzeni dyskowej międzykręgowej. Ustalono, że duże kanały naczyniowe przecinają płytki końcowe we wczesnym okresie życia płodu, które następnie zmniejszają się wraz z urodzeniem i całkowicie znikają w wieku od czterech do sześciu lat, co czyni dysk jednym z największych typów tkanek beznaczyniowych w organizmie. Można spekulować, że obecność wirusowego DNA w krążku międzykręgowym jest wtórna do migracji makrofagów lub innych komórek zawierających wirusowe DNA do krążka w dzieciństwie, podczas gdy środowisko krążka jest nadal bogate w naczynia krwionośne. Inne mechanizmy mogą również odgrywać rolę, ponieważ powszechnie wiadomo, że wirus opryszczki pospolitej może być aktywowany w aksonach neuronalnych przez cytokiny zapalne, takie jak IL-1 i TNF-α 24,25, a poprzez migrację antidromalną może obejmować przestrzeń dyskową.

tak więc stan zapalny lub uszkodzony dysk, który wytwarza różne cytokiny prozapalne, aktywuje ukryte wirusy. Mechanizmy te mogą również wyjaśniać obecność DNA z dwóch lub więcej wirusów w próbkach dysku. Nawet jeśli obecność wirusów jest zjawiskiem wtórnym, ich obecność może przyczynić się do patogenezy zwyrodnienia krążka międzykręgowego, ponieważ antygeny wirusowe dodatkowo zwiększają pogorszenie dysku poprzez aktywację środowiska zapalnego, co ułatwia aktywowane makrofagi i inne komórki powodujące uszkodzenie tkanek.

w naszym badaniu śródoperacyjna ocena pola operacyjnego ujawniła makroskopowe dowody zapalenia otaczającego przepuklinę dysku. Dowody na stan zapalny w próbkach dyskowych i udział infekcji wirusowej w nasileniu procesu zapalnego pochodzą z analizy poziomów mRNA dobrze znanych genów, które są związane ze stanem zapalnym, takich jak TNF-α i IL-6. Oba markery zapalne wykazały około dwa do trzech razy wyższe poziomy w próbkach pacjentów w porównaniu z grupami kontrolnymi. Co ciekawe, próbki zakażone jednocześnie HSV – 1 i CMV wykazywały najwyższe poziomy TNF-α i IL-6, co sugeruje synergiczne działanie wirusów. Dodatkowo, poziom TNF-α był tak niski jak w przypadkach kontrolnych u pacjentów, u których nie mogliśmy wykryć wirusowego DNA.

ostatni artykuł przeglądowy stwierdza, że degeneracja dysku nie jest diagnozą, ale wyrazem stanu dysku, który jest wynikiem kilku czynników działających indywidualnie lub zbiorowo. 1 degeneracja dysku, zamiast być wynikiem jednego procesu, może mieć wiele możliwych przyczyn, w tym mechanicznych, starzenia się, genetycznych, ogólnoustrojowych, toksycznych i/lub infekcji. Brak wykrycia wirusa u wszystkich naszych 16 pacjentów jest zgodny z wieloczynnikową przyczyną wypadania dysku. Wiadomo, że czynniki genetyczne wytwarzają nieprawidłowe składniki macierzy 26-28, które naruszają strukturę i funkcję dysku oraz zwiększają podatność tkanki dysku na naprężenia mechaniczne. 29 badania epidemiologiczne wykazały, że czynniki genetyczne zwiększają ryzyko degeneracji, 30-35, ale nie uwzględniają wszystkich przypadków, 28,36 z różnicami w różnych populacjach etnicznych 37 tak, że wymagane są duże wieloetniczne badania populacyjne. 38

obecność wirusów w dysku może stworzyć ustawienie, w którym dysk jest podatny na uszkodzenia spowodowane naprężeniami mechanicznymi i urazami. Jest prawdopodobne, że wirusowe DNA byłoby obecne na poziomie krążków międzykręgowych, ale naprężenia mechaniczne, które są postulowane, aby przyczynić się do degeneracji odbywają się na poziomie lędźwiowo-krzyżowym, gdzie problemy są znacznie bardziej powszechne. 1 infekcja niskiego stopnia, z wpływem genetycznym lub bez, może zwiększać podatność krążka międzykręgowego na czynniki środowiskowe, które wtórnie napędzają zdarzenia biologiczne prowadzące do degeneracji krążka. Prawdopodobnie opryszczka DNA działa jako czynnik, który zmienia cechy strukturalne matrycy w Dysku modulując apoptozę i miejscową odpowiedź zapalną, sugerując, że zakażenie wirusowe lub reaktywacja jest związana z chorobą.

odkrycie przez Marshalla i Warrena 39, że zakażenie Helicobacter pylori było odpowiedzialne za rozwój wrzodów żołądka, doprowadziło do znacznej zmiany w rozumieniu medycznym. Należy poważnie rozważyć możliwość, że proces zakaźny może przyczynić się do degeneracji dysku.

uważamy, że jest to pierwsze badanie dokumentujące obecność wirusów opryszczki w krążku międzykręgowym u pacjentów z przepukliną krążka. Konieczne są dalsze badania w celu określenia mechanizmów leżących u podstaw i wsparcia potencjalnej roli wirusów opryszczki w patogenezie choroby zwyrodnieniowej dysku.

od podmiotu gospodarczego związanego bezpośrednio lub pośrednio z tematem tego artykułu nie otrzymano ani nie otrzymano żadnych korzyści w jakiejkolwiek formie.