Disc degeneration is a common condition with a complex multifactorial etiology. Foi proposta uma infecção de baixo grau como causa de degeneração do disco com Propionibacterium acne identificada em 84% dos doentes com hérnia discal e ciática utilizando serologia e culturas. Foram também observadas alterações moleculares, tais como o aumento da produção de enzimas catabólicas (catepsina, lisozima e várias metaloproteinases de matriz) e citoquinas inflamatórias. 3 doentes jovens com hérnia do disco lombar mostraram menor recuperação após a cirurgia quando apresentaram elevadas concentrações séricas de proteína C-reactiva de alta sensibilidade (hs-CRP) pré-operatória. No entanto, não é claro se altos níveis de PCR e citocinas inflamatórias indicam uma infecção local ou uma resposta inflamatória à hérnia discal. 4 patógenos como o vírus Parvovírus B19 ou o vírus Epstein Barr (EBV) desempenham um papel importante na patogênese de várias formas de artrite. 5,6 vírus Herpes são uma família diversificada de grandes vírus de DNA, todos os quais podem estabelecer infecções latentes ao longo da vida. A infecção primária com muitos destes vírus é comum durante a infância. 7,8

Este estudo teve por objectivo investigar o papel potencial dos vírus herpes, do vírus herpes Simplex tipo-1(HSV-1), do vírus Herpes Simplex tipo-2 (HSV-2) e do citomegalovírus (CMV), na patogenese da degeneração das disco intervertebrais. Uma análise molecular de amostras de discos intervertebrais obtidas durante a discectomia mostrou uma frequência considerável de ADN CMV e HSV-1 em discos degenerados, sugerindo que as infecções virais podem ser um factor importante na etiologia desta doença.foram estudados doentes e métodos

um total de 16 doentes consecutivos que foram submetidos a discectomia nos seis meses seguintes à hérnia do disco lombar. Havia oito homens e oito mulheres com uma idade média de 40,38 anos (17 a 65). O estudo teve aprovação ética. O diagnóstico de hérnia do disco lombar foi estabelecido por exame físico e ressonância magnética. A fim de fornecer um grupo de controle, amostras de discos foram obtidas percutaneamente de dois pacientes com fraturas de ruptura toracolumba que estavam em operação. Estes doentes foram também submetidos a um exame de IRM pré-operatório para excluir degeneração concomitante. A natureza das amostras testadas neste estudo não permitem a inclusão de mais discos intervertebrais de indivíduos saudáveis por razões éticas, enquanto a alternativa de cadáver de amostras controles, foi abandonado como a maioria da população adulta tem uma história de dor lombar e degeneração de disco.para além do material do disco herniado obtido durante a discectomia, foi colhida uma amostra de sangue periférico de cada doente. Foram colocadas amostras de tecido em polipropileno esterilizado 1.Tubos de 5 ml e conservados a -80°C, até à extracção de ADN/ARN e reacção em cadeia da polimerase/ reacção em cadeia quantitativa da polimerase (PCR/qRT-PCR). A detecção de anticorpos HSV-1 e CMV, IgM+ e IgG+ do plasma foi realizada utilizando um imunoensaio enzimático padrão.extracção de ADN / ARN.

ADN genómico e ARN total foram extraídos das amostras de tecido utilizando o Kit XS de tecido Nucleospino e o kit XS de ARN Nucleospino (Macherey-Nagel GmbH e Co., Düren, Alemanha), respectivamente, de acordo com as instruções do fabricante. O ARN purificado foi ainda tratado com DNaseI para evitar qualquer contaminação de ADN. As concentrações das amostras de ADN e ARN foram determinadas utilizando um espectrofotómetro (260 nm) antes da amplificação PCR ou qRT-PCR.

detecção do ADN dos vírus do herpes.

testamos oito diferentes de vírus do herpes (HSV-1/-2, Varicela Zoster Vírus (VZV), EBV, CMV, Vírus Herpes Humano 6, 7 e 8 (HHV6, HHV7 e HHV8)) usando RhyMA Teste-Herpes Triagem de acordo com as instruções do fabricante (Euroclone, Pavia, Itália). O teste RhyMA baseou-se na tecnologia de hibridação reversa envolvendo amplificação do ADN multiplex pela PCR com primers biotinilados específicos, seguida pela hibridação dos fragmentos de ADN amplificados e biotinilados com faixas em sondas, específicas para cada um dos vírus herpes. Para a avaliação dos resultados foi necessária uma reacção final em desenvolvimento utilizando um sistema de biotina-streptavidina. Controlos positivos e amplificadores também foram incluídos em cada faixa. Para a interpretação dos resultados, a faixa desenvolvida de cada amostra foi alinhada com uma tabela padrão. O teste RhyMA-Herpes Screening é licenciado para uso em diagnóstico in vitro, certificando a elevada especificidade e sensibilidade do ensaio. A fim de verificar os resultados obtidos através do teste de Rima-Herpesvirose, os produtos PCR foram também executados num gel de agarose de baixa fusão de 3%, produzindo o padrão electroforético esperado para cada vírus. Por último, as amostras PCR positivas foram submetidas a uma análise sequenciada directa, confirmando os resultados obtidos através do teste de Rima-Herpes.

HSV – 1 e CMV qRT-PCR.

RNA Total foi transcriptado reverso usando o Kit RETRO-script (Ambion Inc., Austin, Texas, USA) with random hexamer primers. os cDNAs foram testados para a qualidade do modelo através da construção de curvas padrão usando diluições seriais de cada cDNA como modelos em qRT-PCRs. Os modelos cDNA deram uma eficiência de teste de 90% a 105%, e o R2 de todas as curvas padrão foi > 0, 98. Após a transcrição reversa, os cDNAs foram amplificados utilizando iniciadores específicos do ICP0 e do IE1 para a quantificação do HSV-1 e do mRNAs do HCMV, respectivamente, como descrito anteriormente. 9, 10

Todas as qRT-PCRs foram realizadas em triplicado usando Maxima SYBR Green qPCR master mix (Fermentas Inc., Glen Burnie, Maryland) in an ABI PRISM 7500 Sequence Detector (PE Biosystems, Foster City, Canada), including the extracted RNA samples as well as positive and negative controls. A fluorescência verde SYBR foi medida ao longo de 40 ciclos de amplificação. Para cada modelo quantificado, foi calculado o número médio do ciclo no qual a acumulação do produto entrou na gama linear (CT). Os valores de CT replicados estavam dentro de 0,4 ciclos um do outro. O valor CT 18SrRNA para um dado modelo foi subtraído do CT obtido para cada mRNA de interesse (ICP0 e IE1) do mesmo modelo para obter o valor CT normalizado (ΔCT) para cada modelo.expressão do gene do Factor de necrose tumoral-α e da interleucina-6.

para quantificação de mRNA TNF-α Ou IL-6, foi utilizado 1 µl de cDNA juntamente com os iniciadores acima indicados numa reacção de 20 µl, utilizando o verde SYBR como marcador para o teor de ADN. Os primários utilizados foram: beta actin: Forward: 5′ – TCAGAAGAACTC CTA TGT GG-3′, reverso: 5′ – TCT CTT TGA TGT CAC GCA CG-3′; TNF-a Forward: 5′ – CAC GCT CTT CTG TCT ACT GAA CTT CG-3′, reverso: 5′-GGC TGG GTA GAG AAT GGA TGA ACA CC-3′, 11 IL-6: Forward: 5′-ACA GCC ACT CAC CTC TTC AG-3′, reverso: 5′ – GTG CCT CTT TGC TGC TTT CAC-3″. Não estiveram presentes subprodutos na reacção, tal como indicado pelo padrão de dissociação fornecido no final da reacção e pela electroforese em gel de agarose (dados não apresentados). A eficiência de amplificação dos produtos TNF-α e IL-6 foi a mesma que a da actina beta indicada pelas curvas padrão de amplificação, permitindo-nos usar a fórmula: aumento de vezes = 2–(ΔCt a-ΔCtB). As reações foram realizadas em triplicado para permitir a avaliação estatística.

resultados

foi utilizado um teste de hibridação reversa da PCR para detectar o ADN de oito vírus do herpes diferentes em amostras do disco intervertebral de doentes com hérnia do disco (Fig. 1). O ADN do herpesvírus foi detectado em 13 de 16 amostras (81, 25%). O HSV – 1 apresentou a maior prevalência em nove pacientes (56,25%), enquanto o CMV foi detectado em seis pacientes (37,5%) (Tabela I). Dois doentes foram co-infectados com HSV-1 e CMV. O DNA de HSV-2, VZV, EBV, HHV6, HHV7 e HHV8 não foi detectado nas amostras de disco de nenhum dos pacientes. Nenhum dos doentes do controlo (C1 E C2) apresentou resultados positivos para a presença de ADN do vírus do herpes (Fig. 1).

the status of HSV – 1 and CMV infection, in the intervertebral disc specimens was examined by investigating the potential expression of viral transcripts by Real-Time qRT-PCR. A expressão do gene do vírus do Herpes não foi detectada em nenhuma das amostras testadas, demonstrando a ausência de uma infecção viral activa, sugerindo assim o estabelecimento de infecção latente por herpesvírus nestas amostras.foi também examinada a seropositividade dos doentes. Todos os doentes HSV-1 ou CMV PCR positivos apresentaram anticorpos IgG+ para o mesmo vírus, respectivamente (Tabela I). Em três casos para HSV – 1 e em seis casos para CMV, foram detectados anticorpos IgG+ sem prevalência simultânea de ADN viral. Além disso, os anticorpos HSV-1 e CMV IgM+ do sangue periférico foram negativos em todos os doentes, indicando que nenhum dos doentes tinha experimentado uma infecção aguda pelo vírus do herpes na altura da excisão cirúrgica.para além da indicação macroscópica da inflamação em torno do disco herniado, obtivemos também provas experimentais de inflamação nos espécimes dos discos intervertebrais, examinando os níveis de mRNA do TNF-α e IL-6, em todas as amostras utilizando qRT-PCR. A análise revelou um aumento de aproximadamente duas a três vezes dos dois marcadores inflamatórios nas amostras em comparação com os controlos (Fig. 2). Curiosamente, os doentes que foram co-infectados pelo HSV-1 e pelo CMV apresentaram os níveis mais elevados de TNF-α e IL-6. Além disso, dois dos três doentes (doentes 2 e 8) sem evidência de infecção viral apresentaram níveis inferiores de TNF-α. Esta correlação negativa não foi encontrada para os níveis IL-6 nestes doentes.

discussão

o presente estudo sugere o conceito de que a infecção pelo herpesvírus pode promover a degeneração do disco. Conseguimos detectar ADN HSV-1 e CMV num grande número de amostras de disco intervertebral humano colhidas durante a discectomia.foi sugerida uma infecção de baixo grau como possível causa de degeneração do disco. 2,4 vários autores têm enfatizado a relação entre sinais Modic tipo 1 (aumento da intensidade do sinal medular em imagens de MR com ponderação T2 e diminuição da intensidade do sinal em imagens de MR com ponderação T1 e tecido fibrovascular nos endplates) e infecção. 13,14 se os doentes não tiverem dor nas costas, temperatura ou um perfil sanguíneo anormal, é difícil distinguir entre alterações Modic 1 e infecção de baixo grau. 13,14

a relação entre a infecção viral e a apoptose foi amplamente investigada, clarificando os mecanismos de indução da apoptose por vírus. É agora conhecido que o parvovírus B19 e particularmente a sua proteína NS-1, tem um potente efeito citotóxico nas células hospedeiras e causa apoptose nas células infectadas. 17 Os vírus desempenham um papel na patogênese de várias formas de artrite. A Stahl et al 5 detectou ADN viral de vários vírus no tecido sinovial colhido em doentes com artrite precoce. Um estudo recente sugeriu que os estágios avançados da osteoartrite podem estar relacionados com o aumento da inflamação e danos à cartilagem articular devido ao parvovírus B19. Num outro estudo, foi proposto que o parvovírus humano B19 está envolvido no início e perpetuação da sinovite na artrite reumatóide, levando a lesões articulares no decurso da síntese excessiva de citoquinas inflamatórias e enzimas proteolíticas. As infecções por HSV – 1 são endémicas em todo o mundo. Mais de 90% dos adultos têm anticorpos contra o HSV – 1 na quinta década. Os vírus do Herpes são patógenos omnipresentes em crianças, permanecendo latentes após uma infecção activa. 20,21 durante a fase inicial da infecção, a replicação viral ocorre em gânglios com a sobrevivência de algumas células que mantêm o genoma viral compatível com a função celular normal. Este equilíbrio fino entre as células hospedeiras e o vírus pode ser perturbado por vários estímulos, levando à reativação. No nosso estudo, nenhum dos doentes tinha tido infecção aguda por herpes. Isto foi evidente tanto no nível serológico, devido à ausência de anticorpos IgM+ do sangue periférico, bem como no nível molecular devido à falta de transcrições virais de ARNm das amostras de disco. Assim, a alta prevalência da infecção HSV-1 na infância, bem como a sua retenção no sistema nervoso, pode oferecer uma explicação satisfatória da presença de ambos HSV-1 e CMV no disco intervertebral.

a questão surge como os vírus entram no espaço de disco intervertebral. Está bem estabelecido que grandes canais vasculares atravessam as placas finais durante a vida fetal precoce, que posteriormente diminuem com o nascimento e desaparecem completamente aos quatro a seis anos de idade, tornando o disco um dos maiores tipos de tecido avascular do corpo. Pode-se especular que a presença de DNA viral no disco intervertebral é secundária à migração de macrófagos ou outras células que contêm DNA viral para o disco durante a infância, enquanto o ambiente do disco ainda é rico em vasos sanguíneos. Outros mecanismos também podem desempenhar um papel, pois é bem conhecido que o vírus herpes simplex pode ser ativado em axônios neuronais por citocinas inflamatórias, tais como IL-1 e TNF-α 24,25 e através da migração antidromal pode envolver o espaço do disco.assim, o disco inflamado ou ferido, que produz uma variedade de citocinas pró-inflamatórias, activa os vírus latentes. Estes mecanismos também podem explicar a presença de DNA de dois ou mais vírus nas amostras de disco. Mesmo que a presença de vírus seja um fenômeno secundário, a sua presença pode contribuir para a patogênese da degeneração do disco intervertebral, uma vez que os antigénios virais aumentam ainda mais a deterioração do disco através da ativação do meio inflamatório, o que facilita macrófagos ativados e outras células para causar danos nos tecidos.no nosso estudo, a avaliação intra-operatória do campo cirúrgico revelou evidência macroscópica de inflamação em torno do disco herniado. A evidência da inflamação nos espécimes do disco e a contribuição da infecção viral para o aumento do processo inflamatório veio da análise dos níveis de ARNm de genes bem conhecidos, que estão associados com a inflamação, tais como TNF-α e IL-6. Ambos os marcadores inflamatórios demonstraram níveis aproximadamente duas a três vezes mais elevados nas amostras dos doentes em comparação com os controlos. Curiosamente, as amostras que foram co-infectadas pelo HSV – 1 e pelo CMV apresentaram os níveis mais elevados de TNF-α e IL-6, sugerindo um efeito sinérgico dos vírus. Adicionalmente, os níveis de TNF-α foram tão baixos como os casos de controlo entre os doentes em que não foi possível detectar ADN viral.um artigo de revisão recente afirma que a degeneração do disco não é um diagnóstico, mas uma expressão do Estado do disco, que é o resultado de vários fatores atuando, individual ou coletivamente. 1 em vez de ser o resultado de um único processo, a degeneração do disco pode ter uma série de possíveis causas, incluindo mecânica, envelhecimento, genética, sistémica, tóxica e/ou infecção. A ausência de detecção viral em todos os nossos 16 pacientes está de acordo com a causa multifactorial do prolapso discular. Sabe-se que os fatores genéticos produzem componentes anormais da matriz 26-28 que comprometem a estrutura e a função do disco e aumentam a susceptibilidade do tecido do disco ao estresse mecânico. 29 estudos epidemiológicos mostraram que os fatores genéticos aumentam o risco de degeneração, 30-35, mas eles não contabilizam todos os casos, 28,36 com variações entre diferentes populações étnicas 37, de modo que grandes estudos de população multi-étnica são necessários. 38

a presença dos vírus no disco pode criar um ambiente onde o disco é vulnerável a danos por stress mecânico e trauma. É provável que o DNA viral esteja presente nos níveis dos discos intervertebrais, mas as tensões mecânicas que são postuladas para contribuir para a degeneração ocorrem no nível lombosacral, onde os problemas são muito mais comuns. 1 infecção de baixo grau, com ou sem influência genética, pode aumentar a susceptibilidade do disco intervertebral a fatores ambientais, que secundariamente conduzem os eventos biológicos resultando em degeneração do disco. Possivelmente, o ADN do herpes actua como um factor que altera as características estruturais da matriz no disco, modulando a apoptose e a resposta inflamatória local, sugerindo que a infecção viral ou reactivação está associada à doença.a descoberta por Marshall e Warren 39 de que a infecção por Helicobacter pylori foi responsável pelo desenvolvimento de úlceras gástricas levou a uma grande mudança na compreensão médica. A possibilidade de um processo infeccioso poder contribuir para a degeneração do disco deve ser seriamente considerada.acreditamos que este é o primeiro estudo que documenta a presença de vírus herpes no disco intervertebral de pacientes com hérnia discal. São necessários estudos adicionais para determinar os mecanismos subjacentes e apoiar o papel potencial dos vírus herpes na patogênese da doença degenerativa do disco.

quadro I. Características clínicas dos pacientes com herniação do disco lombar, e a prevalência do Vírus Herpes Simplex tipo 1 (HSV-1) e Citomegalovírus (CMV) no disco intervertebral amostras

Paciente	Anos	Gênero	do HSV-1	CMV
1	50	F	+	+
2	25	F	−	−
3	23	F	+	−
4	17	M	+	−
5	28	M	−	+
6	42	F	+	−
7	37	F	+	−
8	52	M	−	−
9	44	M	+	−
10	33	F	+	−
11	40	M	+	−
12	42	M	−	+
13	51	F	+	+
14	44	M	−	+
15	53	F	−	+
16	65	M	−	−

não foram recebidos nem serão recebidos quaisquer benefícios sob qualquer forma de uma parte comercial directa ou indirectamente relacionada com o objecto do presente artigo.

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