equação de WEAVER-BURK duplo gráfico recíproco da cinética enzimática

8.3. Equação de Lineweaver-Burk (gráfico duplo recíproco) :

em 1934, Lineweaver e Burk fizeram uma simples alteração Matemática na equação de Michalies –Menten, traçando uma dupla inversão da concentração do substrato e da taxa de reação.

Linha weaver Burk enredo é obtida tomando-se o recíproco de ambos os lados do michalies–Menteris equação (MME).

Na linha weaver Burk (LB) traçar o Michaelis Menten equação é convertido em linha reta linha curva.

It is used to estimate the Vmax from the position of intercept on the X-axis.

• a recta é dada por Y = MX + C, onde C é a ordenada da regressão de Y em X e M é o declive.
• se o valor M aumentar, então o declive aumenta.
• se fizermos o valor de Vmax igual a constante então o valor Km é alto e se o valor Km é constante, o valor Vmax diminui.

a curva hiperbólica se torna uma linha reta e valor absoluto de X-intercepção da linha é o de afinidade (1/Km) da enzima para o substrato. A intercepção Y é 1 / Vmax. O declive da linha é Km / Vmax. Mais uma vez, originalmente isso foi feito subjetivamente. É o método mais fino para encontrar os parâmetros mais adequados para a relação Michaelis-Menten não traduzida.

Application

The Lineweaver–Burk plot use to determine the Km and Vmax,. A intercepção em Y de tal grafo é equivalente ao inverso de Vmax; a intercepção em X do grafo representa -1/Km. Dá uma impressão rápida e visual das diferentes formas de inibição enzimática.

8.4. Eadie–Hofstee Enredo

Eadie–Hofstee diagrama é uma representação gráfica da cinética enzimática em que a taxa de reação é plotado como uma função da relação entre a taxa e o substrato de concentração:

neste Michaelis Menten equação é representada como

Invert e multiplicar com o Vmax :

Aplicação de Eadie–Hofstee Enredo

identificação Rápida de Km e Vmax

8.5. Hanes Woolf Plot

representação gráfica da razão entre a concentração inicial do substrato e a velocidade de reação V é representada contra a concentração do substrato .

Michaelis-Menten equação é derivada como

Invert e Multiplicar por :

Rearrange :

This equation will give straight line of slope a Y-intercept of and an X-intercept of –km

Application :-

Used for determination of Km, Vmax and Vmax/Km parameters

8.6. Inibição enzimática

as enzimas são proteínas que actuam como catalisadores das reacções. Mas há atividade é inibida ou bloqueada pelas moléculas que são substâncias químicas (orgânicas / inorgânicas) na natureza. Estas moléculas ou compostos são chamados inibidores e o processo pelo qual inactivam a enzima ou bloqueiam a sua actividade é chamado inibição enzimática.

inibem a actividade catalítica enzimática de forma reversível ou irreversível, modificando as cadeias laterais de aminoácidos necessárias para a actividade enzimática.

na descoberta de drogas, os análogos de drogas são projetados para a desintoxicação de muitas antitoxinas como eles têm ação inibitória.

8.6.1. As regras seguidas pelas reacções de inibição enzimática

1. a enzima liga-se ao substrato numa razão de 1 : 1 no local activo num mecanismo de bloqueio ou num ajuste induzido.
2. Os compostos inibidores competem com o substrato para o local catalítico alostérico na primeira base para fazer complexos de substratos de inibidores enzimáticos ou complexos de inibidores enzimáticos.
3. enzima e substrato ou inibidores reagem uns com os outros de uma forma cinética que é expressa como constantes cinéticas de uma reacção catalítica.
4. condições fisiológicas como pH, temperatura, concentração de substrato ou reagentes determinam a taxa de reacções enzimáticas.
5. formas intermoleculares entre subunidades enzimáticas, interacções com substratos ou inibidores do grupo activo, propriedades físicas de natureza de ligação: natureza electrofílica , hidrofílica, nucleofílica e metaloproteína; a ligação do hidrogénio afecta as taxas globais de reacção enzimática e o modo de inibição.

8.6.2. Tipos de inibição enzimática Inreversível

8.6.2.1. Inibição competitiva (reversível) : neste contexto, existe concorrência entre o inibidor e o substrato para o local activo.

Catalítico site da enzima é ocupada por inibidor e a sua atividade é inibida. Mas a inibição é reversível. Neste caso, formam-se o substrato enzimático e o complexo inibidor enzimático.

efeito na afinidade :- quando a concentração de inibidores aumenta a sua afinidade, mas a afinidade do substrato diminui e o valor do Km aumenta. Mas quando a concentração do substrato aumenta a sua afinidade aumenta e a afinidade do inibidor diminui e o valor do Km diminui, ou seja,,

O novo km é dado por Km, onde

onde

I = concentração do inibidor

Kdi = constante de dissociação do inibidor.

quando a concentração de inibidores aumenta, o valor km aumenta à medida que a afinidade do substrato diminui. Se a constante de dissociação de é mais, complexo de inibidores enzimáticos mais, a é menos assim km é menos. O valor de a é igual a 1 ou maior do que 1. Novo valor de Km é aKm

Efeito sobre Vmax

Vmax é calculado no infinito concentração de substrato.

Vmax = Kcat

na concentração infinita do substrato todas as enzimas estão na forma de complexo de substrato enzimático I.e. Vmax is not affected.

Lineweaver Burk plot of competitive inhibition

8.6.2.2. Examples of Competitive Inhibitors

(a) Allopurinol :

Drug used for treatment of gout. Uric acid is formed in the body by oxidation of hypoxanthine by the enzyme xanthine oxidase. Allopurinol is structurally similar to hypoxanthine and inhibits the enzyme xanthine oxidase and reduced uric acid formation.

(b) Metotrexato :

é um inibidor competitivo da diidrofolato redutase (DHFR). Este medicamento é usado para terapia contra o cancro. É estruturalmente semelhante ao ácido fólico, inibindo assim a folato redutase competitivamente. Previne a formação de hidrofolato tetra. Portanto, a síntese de DNA é sofrida.

(c) inibidores da MAO (monoamino Oxidase):

eles são, primeira classe de antidepressivos a ser desenvolvidos. Os inibidores da MAO aumentam o nível de dopamina de serotonina inibindo a MAO. exemplo. Catecolaminas (epinefrina e norepinefrinas).

(d) Dicumarol :

Este medicamento é semelhante à vitamina K. warfarin agir como um anticoagulante por inibindo competitivamente a vitamina K.

8.6.3. Inibição não competitiva

não existe concorrência entre o inibidor e o substrato, uma vez que os locais de fixação do substrato e do inibidor são diferentes. O inibidor não tem semelhança estrutural com o substrato, pelo que não se pode ligar à enzima livre. Os inibidores ligam-se ao complexo de substrato enzimático que expõe o local de ligação do inibidor. A ligação de inibidores pode causar distorção do local activo ou do local alostérico que inactiva a catálise.

Efeito de afinidade :

Alta afinidade de inibidor, significa baixa dissociação do substrato enzimático complexo de enzimas substrato. Neste caso, o inibidor liga-se a outro local então activo no complexo de substrato enzimático. Isso significa que os inibidores mostram afinidade para o complexo de ES e não para a enzima. Assim, na presença de inibidores, aumenta a afinidade da enzima em relação ao substrato. Isto diminui o Km. Portanto

Efeito sobre Vmax

Vmax é calculado no infinito concentração de substrato. Na concentração infinita de substrato, todas as enzimas são na forma de complexo de substrato de enzimas. O inibidor mostra afinidade para o complexo de substrato de enzimas. Assim, o inibidor liga-se ao complexo de substrato de enzimas e impede a catálise do complexo de substrato enzimático Em Enzima e produto. That’s why Vmax decreases and new Vmax is given by

Inhibitor concentration increases a value increases and Vmax decreases

On putting the values of new Km and new Vmax in lineweaver burk plot, The equation is as follows :-

Uncompetitive inhibitor causes different intercepts on both Y and X-axis but same slope.

8.6.4. Inibição mista (não competitiva)

este inibidor não é semelhante ao substrato estruturalmente, mas pode ligar-se ao complexo enzimático livre e ao subestado enzimático.

Quando o inibidor liga-se à enzima longe dos sítios ativos. Induz as mudanças conformacionais e reduz sua atividade catalítica. Assim, inibidores enzimáticos e complexos inibidores enzimáticos tornam-se não produtivos. A concentração do substrato não inverte a reacção. Assim, a inibição conduz a Km inalterados, mas reduz o Vmax.

Lineweaver Burk enredo é usado para determinar Km e Vmax em cinética enzimática. A interceptação em Y de tal grafo é equivalente ao inverso de Vmax, a interceptação em X do grafo representa inibidores competitivos, daí as mesmas interceptações em Y (como Vmax não é afetada por inibidores competitivos), mas existem diferentes slops.

inibidor não competitivo produz parcela com a mesma interceptação X que Km não é afetada, mas diferentes encostas com intercepções em Y.

8.7. Cinética da reacção Multisubstrato

na cinética enzimática, as reacções simples envolvem um substrato ligado a uma enzima e submetidas a reacções catalíticas. Esta condição não é comum. A maioria das reações bioquímicas catalisadas por dois ou mais substratos participando das reações. Por exemplo, uma enzima E, catalisada a reação envolvendo dois substratos A e B e do rendimento do produto de P e Q.

Este tipo de reação é chamada de Bi-reacção do Substrato . Estas reações podem prosseguir de duas maneiras:

8.7.1. Sequencial

Ambos os substratos A e B, ligam-se à enzima E, e, em seguida, reações de receitas para produzir produtos P e Q

Este tipo de reação é chamada sequencial ou simples-deslocamento reações que são divididas em grupos seguintes.

ligação ordenada do substrato ou mecanismo sequencial ordenado – neste tipo, um substrato deve ligar-se antes de um segundo substrato.

esta reacção indica a ligação sequencial dos substratos, bem como a libertação sequencial do produto. Este tipo de mecanismo é observado nas reacções catalisadas por desidrogénios de lactato envolvendo NAD+ e lactato.

8.7.2. Ligação aleatória do substrato – neste tipo A ou B pode ligar-se à enzima em primeiro lugar, seguida do outro substrato e da libertação do produto.

This type of mechanism is observed in reactions catalyzed by transferases enzyme as hexokinase catalyzed phosphorylation of glucose by ATP.

8.7.3. Theorell-Chance Sequential mechanism

It is a type of ordered sequential bisubstrate reaction in which the ternary complex does not accumulate.

8.7.4. Mecanismo de Ping pong

a outra possibilidade na reação de dois substratos é que um substrato, A, se liga à enzima e ao reagir com ela um produto, P, é liberado e a enzima se transforma em uma forma modificada, E’. O segundo substrato, B, vem e liga-se com modificado enzima para produzir segundo produto, Q e regenerar a enzima, E.

As reações a seguir o mecanismo acima são chamados de Ping-Pong ou duplo deslocamento reações. Este tipo de mecanismo é observado em reacções catalisadas pelas aminotransferases.

estas enzimas catalisam a transferência de um grupo amino de um aminoácido para um ácido α-ceto.Os produtos formados são um novo aminoácido correspondente ao ácido ceto e um novo ácido ceto correspondente ao esqueleto de carbono do aminoácido, tais como:-

outro exemplo de reação do ping pong é o fosfoglicerato mutase. A enzima obtém fosfato de um substrato e, após a fosforilação da enzima, o fosfato é transferido para o segundo substrato.

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