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os vírus experimentam ambientes completamente diferentes dependendo se estão a replicar-se dentro de uma célula hospedeira ou em trânsito de um hospedeiro para outro. Dentro de uma célula, o vírus e os componentes do vírus são expostos a um ambiente redutor, onde o potencial redox é determinado principalmente pela glutationa (18). Em contraste, fora de uma célula, o vírus é exposto ao oxigênio e produtos tóxicos derivados do oxigênio, tais como peróxido de hidrogênio, superóxido, e radical hidroxilo, espécies reativas que têm o potencial de inativar o vírus. Para lidar com esses compostos altamente reativos, plantas e animais expressam enzimas capazes de convertê-los em produtos não-tóxicos. Exemplos de tais enzimas são catalase, peroxidases e superóxido dismutase (28). Aqui, descrevemos os resultados de estudos que demonstram a presença de catalase dentro do virião herpes simplex purificado. Foram então realizados testes para determinar se a catalase interna poderia proteger o vírus da inactivação por H2O2.foram realizados estudos de catalase com o vírus herpes simplex 1 (HSV-1), cultivado em células Vero em cultura e purificado por centrifugação com gradiente de densidade de sacarose. Quando as suspensões de vírus foram ajustadas a 1% H2O2, as bolhas de oxigénio começaram a formar-se rapidamente, indicando a presença de catalase (Fig. 1a, tubo esquerdo). As bolhas tornaram-se visíveis visualmente após alguns segundos de incubação à temperatura ambiente e continuaram a formar-se e a aumentar durante pelo menos 20 minutos. No entanto, não se formaram bolhas se o inibidor da catalase azida de sódio foi adicionado à suspensão viral antes do tratamento com H2O2(Fig. 1a, right). Os ensaios também foram negativos quando (i) o vírus foi removido da solução por centrifugação antes da adição de H2O2, ou (ii) de HSV-1 capsids (B capsids) foram substituídos por intacto vírus. Em ensaios semelhantes, não foram observadas bolhas que indicassem a presença de catalase com vírus da estomatite vesiculosa purificada ou adenovírus humano 2 (Dados Não apresentados). A análise Western blot confirmou a presença de catalase associada ao vírus HSV – 1, mas não com adenovírus, vírus da estomatite vesiculosa (VSV) ou capsídeos HSV-1 A (Fig. 1b).
identificação da catalase associada ao HSV-1 por ensaio enzimático (a), análise do western blot (B) e centrifugação do gradiente de densidade de sacarose (c). O painel a mostra um tubo contendo HSV-1 20 min purificado após a solução ter sido ajustada para 1% H2O2 (tubo esquerdo) e uma incubação semelhante à qual foi adicionado um inibidor da catalase (azida de sódio 2 mM) antes de H2O2 (direita). Observe a formação de bolhas no tubo esquerdo, indicando a presença de catalase no vírus. A concentração do vírus foi de 0, 25 mg/ml em TNE (0, 01 M Tris-HCl, 0, 5 M NaCl, 1 mM EDTA, pH 7, 5) e a incubação foi à temperatura ambiente. O vírus foi a estirpe KOS do HSV-1, que foi cultivada em culturas monolamadas de células Vero e purificada por centrifugação com gradiente de densidade de sacarose, e o título foi determinado por diluição final, tal como descrito anteriormente (14). O painel b mostra os resultados de um teste Western blot para a presença de catalase no HSV-1, adenovírus humano 2 (HAd2), vírus da estomatite vesiculosa (VSV) e capsides HSV-1 A. Adenovírus humano 2 e estomatite vesiculosa (Indiana); Foram cultivadas em culturas monocamadas de células HeLa e Vero, respectivamente, e purificadas através de procedimentos previamente descritos (12, 17). Métodos publicados também foram usados para a purificação de capsídeos HSV-1 A E B (23). As principais proteínas da capsida foram detectadas através da coloração da mancha com 1% de Ponceau S (fila superior), enquanto que a catalase foi detectada por imunoformação com anticorpos específicos para a catalase (Calbiochem; coelho policlonal 219010; 1:5000 diluição) (15). Note que a catalase foi detectada no vírus HSV – 1, mas não no HAd2, VSV, ou HSV-1 a capsids. O painel c mostra os resultados da análise do gradiente de densidade da sacarose. Centrifugou-se um total de 50 µg de HSV-1 purificado em 50 µl TNE com um gradiente de 600 µl de sacarose em TNE de 20% a 50%. A centrifugação foi de 45 min 22.000 rpm em um Beckman SW55 rotor, a 4°C. O gradiente foi fracionado, individual e frações foram analisadas por SDS-PAGE seguido por blotting para polivinilideno difluoride (PVDF) e coloração com 1% Ponceau S. A mancha, em seguida, foi destained e corados com anticorpo específico para a catalase (que migrou coincidentemente com o padrão de catalase; Worthington LS001872). Note que a posição do vírus no gradiente (linha superior) coincide com a da catalase (linha inferior), sugerindo que os dois estão associados.foram realizadas experiências de controlo de
para confirmar que a catalase estava associada ao HSV-1 e não a impurezas presentes na preparação do vírus. O HSV-1 purificado foi centrifugado para uma banda num gradiente de densidade de sacarose, o gradiente foi fraccionado, e a análise de Western blot foi usada para testar frações de gradiente individuais para a presença de catalase. Os resultados mostraram que catalase estava presente em frações contendo vírus, mas não em frações flanqueadas (Fig. 1c). Os resultados são interpretados para indicar que a catalase está associada com HSV-1 e não com contaminantes, tais como bactérias contendo catalase ou materiais das células hospedeiras na preparação do vírus. Uma vez que o genoma HSV-1 não codifica a catalase (22), a enzima associada ao vírus deve ser derivada da célula hospedeira. Estudos iniciais do vírus da vaccinia demonstraram a presença de catalase no virião Maduro (8). Para além desta observação, não conhecemos qualquer outro relatório da catalase como componente de uma estrutura viral.a análise adicional da catalase associada ao HSV-1 visou determinar a localização da enzima no virião. Foram feitos dois tipos de experiências. Primeiro, o vírus purificado foi tratado com a enzima proteolítica pronase para degradar as glicoproteínas virais e quaisquer proteínas Não contidas na membrana do virião. Espera-se que as proteínas virais internas não sejam afectadas, uma vez que a pronase não atravessa a camada de bilayer lipídica do vírus (16). Após o tratamento da pronase, o vírus foi colhido por centrifugação, e a extensão da perda da catalase foi determinada pela análise Western blot. Os resultados não mostraram evidência de perda de catalase em duas concentrações de vírus testadas (ver a banda de catalase na Fig. 2a, faixas 1 e 2). Os controlos internos demonstraram que as glicoproteínas de superfície do vírus gB e gH foram clivadas como esperado(Fig. 2a; compare faixas 2 e 3). Do mesmo modo, a análise Western blot demonstrou que a glicoproteína D HSV-1 foi digerida pela pronase ou tripsina em condições nas quais a catalase não foi afectada (Fig. 2b). A catalase purificada em solução também foi digerida nas mesmas condições. Em contraste, nenhuma degradação do tegumento interno (UL47, UL48, e UL49) ou proteínas capsides (UL19, UL38, UL18; Fig. 2a, faixas 1 e 2). Os resultados são interpretados para indicar que a catalase está localizada dentro do envelope HSV-1.
Localization of catalase in HSV – 1 by treatment of purified virions with pronase (lanes 1 to 3) and Triton X-100 (a, lanes 4 and 5) and by pronase and tripsin treatment (b, lanes 1 to 3). O painel a mostra a análise de SDS-PAGE e Western blot de proteínas presentes em HSV-1 intacto (faixas 3 e 4) e em viriões após tratamento com pronase (faixas 1 e 2) e Triton X-100 (Faixa 5). Note – se que a catalase estava presente em viriões intactos (faixas 3 e 4) e em viriões tratados com pronase (faixas 1 e 2), mas não em viriões após tratamento com 1% de Triton X-100 (Faixa 5). Pronase tratamento foi realizado pela digestão purificada HSV-1 (0,25 mg/ml) com 1 mg/ml pronase (Streptomyces griseus; Calbiochem 537088) por 4 h a 37°C. Após pronase tratamento, o vírus foi reisolated por gradiente de densidade de sacarose centrifugação antes de SDS-PAGE e Western blot. O tratamento com Triton X-100 foi efectuado ajustando o vírus purificado a 1% Triton X-100 em tampão TNE contendo ditiotreitol a 10 mM (DTT) e incubando durante 15 minutos Gelo (4°C). Os capsídeos resultantes foram então purificados por centrifugação com gradiente de sacarose antes da análise SDS-PAGE e Western blot. b) análise Western blot do HSV-1 purificado após tratamento in vitro com pronase ou tripsina. Um total de 100 µl de HSV-1 purificado (1 mg/ml) foi ajustado para 2 mg/ml de pronase ou 2 mg/ml de tripsina. Uma incubação de controlo não tinha enzima. As misturas foram incubadas durante 2 h a 37 ° C, e os viriões foram purificados longe das enzimas por centrifugação num gradiente de sacarose de 20% a 50%, como descrito na legenda à Fig. 1. As amostras de vírus foram granuladas por centrifugação e examinadas por análise de manchas de SDS-PAGE e Western. Blots foram manchados para catalase (coelho policlonal; ver acima) e glicoproteína D (anticorpo monoclonal DL11 de ratinho; um presente de Gary Cohen e Roselyn Eisenberg; 1:5000). Note – se que o tratamento com protease causou a digestão da glicoproteína D, mas não da catalase, indicando que a catalase está localizada no interior da membrana HSV-1.uma definição mais precisa para a localização da catalase foi obtida através do tratamento do vírus purificado com o detergente não iónico Triton X-100 (TX-100). Quando realizado com vírus fresco, este tratamento causa a perda da membrana do vírus, as glicoproteínas da membrana, e quase todas as 20 ou mais proteínas tegumentos (todas menos UL36, UL37 e US3) (13, 21, 27). O capsídeo mantém sua integridade, no entanto, e nenhuma das principais proteínas capsídeas são perdidas. O ADN do vírus é mantido dentro do capsid. As experiências envolveram o tratamento do HSV – 1 com 1% TX-100 e o isolamento dos capsídeos resultantes por centrifugação com gradiente de densidade de sacarose. Western blot analysis was then used to test the capsids for the presence of catalase. Os resultados demonstraram que as glicoproteínas virais e as proteínas tegumentos foram removidas como esperado e que a catalase foi também removida (ver Fig. 2a, faixas 4 e 5). Este experimento é interpretado para indicar que a catalase está presente no tegumento HSV-1.informação tal como a apresentada na Fig. 2 pode ser usado para determinar o número de moléculas de catalase por virião HSV-1 (15). Esta medição teve início com duas alíquotas idênticas de vírus purificado. Os dois foram usados para determinar (i) O número de principais moléculas de proteína de capsídeos (UL19) a partir de um gel corado azul de Coomassie e (ii) o número de moléculas de catalase de 60 kDa a partir de uma mancha Ocidental calibrada. Numa determinação representativa, esta análise rendeu um valor de 1: 207.5 para a razão molar da catalase para UL19. Uma vez que existem 955 moléculas UL19 por HSV-1 capsid, o número de moléculas de catalase por capsid foi determinado para ser 955/207.5 ou 4.6. Uma segunda determinação similar rendeu um valor de 7,1 moléculas de catalase. Como existem quatro subunidades de 60 kDa numa molécula de catalase activa (11, 20), os resultados indicam a presença de tetramers de 1 a 2 catalases por virião.a presença de catalase no interior do virião HSV-1 sugere a possibilidade de estar envolvida na protecção do vírus contra danos oxidativos por H2O2. Em alternativa, a catalase pode ser passivamente incorporada no HSV – 1, uma vez que o tegumento é adicionado no citoplasma da célula hospedeira e não tem qualquer função protectora. Para distinguir entre as duas possibilidades, examinámos a sensibilidade do HSV-1 purificado à inactivação por H2O2in vitro. O HSV – 1 foi tratado com H2O2 na presença ou ausência do inibidor da catalase azida de sódio (NaN3) e o título do vírus foi determinado posteriormente (na ausência de inibidor da catalase). Os resultados mostraram que, enquanto 50 mM H2O2 produziram uma diminuição modesta no título (3 a 4 vezes), observou – se um efeito letal igual ou superior a 106 vezes se o NaN3 estivesse presente (Tabela 1). Os experimentos de controle mostraram pouca matança de HSV – 1 apenas por NaN3 (Tabela 1). Os resultados são interpretados para indicar que a catalase proporciona um nível significativo de protecção contra a inactivação do HSV-1 por H2O2.
Tabela 1
o Vírus do título depois do tratamento com H2O2, com ou sem um catalase inibidor (NaN3)um
| Tratamento | Título | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| O tempo em 10 mM de H2O2 | Tempo em 50 mM de H2O2 | |||||
| None | 2 h | 20 h | None | 2 h | 20 h | |
| Não NaN3 | 28 × 1010 | 60 × 1010 | 8 × 1010 | 28 × 1010 | 10 × 1010 | 8 × 1010 |
| 2 mM NaN3 | 30 × 1010 | 6 × 1010 | <104 | 30 × 1010 | 1 × 1010 | <104 |
não se espera que o HSV-1 tenha de ser protegido de danos oxidativos por H2O2 enquanto estiver associado a uma célula hospedeira. Como descrito acima, um ambiente redutor é encontrado dentro da célula, e isso impediria a formação de H2O2. Fora da célula hospedeira, no entanto, o ambiente é um oxidante, capaz de produzir H2O2 tanto dentro do vírus e no meio circundante. O HSV-1 depararia com este ambiente, uma vez que é transmitido de um hospedeiro para outro, e a catalase pode estar envolvida na protecção da infecciosidade do HSV-1 durante o trânsito. A catalase associada ao HSV-1 pode também proporcionar protecção contra o H2O2 produzido por bactérias comensais ou outras fontes. Foi demonstrado que o H2O2 produzido por lactobacili, por exemplo, protege o tracto genital feminino da doença devido a infecção microbiana (4). Devido à sua elevada taxa catalítica, a catalase associada ao vírus pode ter um papel na proteção do HSV-1, apesar do seu baixo número de cópias (1 a 2 cópias por virião). A catalase hepática, por exemplo, é capaz de desintoxicar dezenas de milhões de moléculas de H2O2 por segundo, entre as maiores taxas catalíticas relatadas para qualquer enzima (2).todos os vírus da família do herpes têm um tegumento, uma camada de proteína que se encontra entre o vírus capsid e a membrana.(5, 6, 9, 13). O tegumento HSV-1 tem 40 a 50 nm de espessura e consiste em aproximadamente 20 espécies proteicas distintas, quase todas codificadas no genoma do vírus. As proteínas tegumentos diferem substancialmente na sua abundância no virião com 800 cópias ou mais das espécies principais, tais como UL47, UL48 e UL49 (ver Fig. 2a, lane 3) (5, 16). Muitas proteínas tegumentos estão envolvidas em fases iniciais da replicação HSV-1, tais como a ativação da transcrição genética precoce e atenuação da síntese de proteínas das células hospedeiras (13, 24, 25). O tegumento é montado no nascente virião HSV-1 como um grupo de botões de capsídeos contendo ADN numa vesícula da rede trans-Golgi (10). Sugere-se que a catalase é incorporada juntamente com outras proteínas tegumentos durante o processo de brotação.
em células não infectadas, a maioria da catalase é encontrada isolada em peroxissomas (26). Para que possa ser incorporada na progenitura HSV-1 durante a tegumentação como descrito acima, a catalase teria de ser libertada dos peroxissomas. Sugerimos que isso possa ocorrer como consequência do rearranjo em larga escala de membranas citoplásmicas que acompanha a replicação HSV-1 (1).Palamara et al. (19) demonstraram que a concentração de glutationa citoplásmica diminui imediatamente após as células Vero estarem infectadas com HSV-1. Espera-se que uma diminuição na concentração de glutationa cause uma diminuição no potencial de redução citosólica, e esta diminuição parece potenciar a replicação HSV-1. Verificou-se que a glutationa extra fornecida no meio de crescimento antagoniza o crescimento HSV-1 (19). Como a glutationa adicionada externamente, a catalase citosólica pode aumentar o potencial de redução do citoplasma através da remoção de H2O2. Sugere-se, portanto, que uma consequência da incorporação da catalase nos viriões da progénie pode ser potenciar o crescimento do vírus privando as células infectadas da catalase.o pequeno número de moléculas de catalase por virião pode explicar porque não foi detectado numa análise espectrométrica de massa de viriões HSV-1 Inteiros (7). Existem várias proteínas do virião HSV-1 de elevado número de cópias que podem obscurecer o sinal da catalase (por exemplo, existem milhares de cópias de moléculas de glicoproteína e 955 cópias da principal proteína capsid ). A abundância de catalase não corresponde ao padrão informal de detecção por espectrometria de massa (visibilidade num gel de página SDS manchado de Coomassie). A peroxiredoxina, uma proteína peroxisómica com actividade antioxidante, foi detectada na análise espectrométrica de massa do HSV – 1 (7, 26).no futuro, poderá ser possível explorar a sensibilidade do HSV – 1 aos efeitos citotóxicos do H2O2. Espera-se que o vírus seja especialmente vulnerável quando se encontra num ambiente oxidante fora da célula hospedeira e quando a catalase é inibida.
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