introduktion

oftalmisk postherpetisk neuralgi (PHN) är ett inaktiverande och omfattande undersökt neuropatisk smärttillstånd orsakat av herpes zoster och kvarstår eller återkommer i minst 3 månader i områden som tillhandahålls av oftalmisk uppdelning av trigeminusnerven (IHS-klassificering, 2013).1

studier som bedömer kutan innervation i hudbiopsiprover har gett ny inblick i mekanismerna bakom neuropatisk smärta under flera tillstånd (Sommer och Lauria, 2007). Hudbiopsi är ett minimalt invasivt diagnostiskt verktyg som används för att bedöma nervfiber i människans epidermis och dermis. Epidermal innervation består huvudsakligen av omyeliniserade C-fiberterminaler, med relativt få små myeliniserade a-fibrer som förlorar sin myelinhölje och når epidermis som omyeliniserade fria nervändar. Omvänt består dermal innervation huvudsakligen av stora myeliniserade a-fibrer som skickar grenar till dermala kroppar och hårsäckar (Nolano et al., 2003, 2013).

de flesta morfometriska studier använde ljusfältimmunohistokemi med proteingenprodukt (PGP) 9,5 immunfärgning och bedömd epidermal innervation ensam. Ett tillvägagångssätt baserat på immunofluorescens och konfokal mikroskopi med användning av dubbel och trippel immunfärgning med en omfattande panel av antikroppar inklusive pan-neuronal markör PGP 9.5, källarmembranmarkören, kollagen IV (ColIV) och antikroppar för olika myeliniserade och omyeliniserade nervfiberpopulationer har visat sig ge distinkt information om sensoriska och autonoma nervfibrer och eventuellt bedöma hudinervering mer exakt (Doppler et al., 2012; Nolano et al., 2013).

Även om tidigare hudbiopsistudier har visat en allvarlig epidermal nervfiber (ENF) förlust i de drabbade thoraxdermatomerna hos patienter med PHN (Oaklander, 2001; Petersen et al., 2010) undersökte de inte direkt oftalmisk PHN, och de skilde inte heller epidermala omyeliniserade och dermala myeliniserade fibrer eller specificerade noggrant autonom nervfiberinvolvering. Att ha denna information kan mer exakt definiera de patofysiologiska mekanismerna som ligger till grund för PHN, vilket möjligen förbättrar hur vi diagnostiserar och botar detta exceptionellt läkemedelsresistenta neuropatiska smärttillstånd.

fortsätter vårt forskningsintresse i mekanismerna bakom neuropatisk smärta vid perifera nervsjukdomar (Truini et al., 2014) inklusive PHN (Truini et al., 2008), i denna kliniska och morfometriska studie syftade vi till att undersöka hur oftalmisk PHN påverkar myeliniserade och omyeliniserade sensoriska och autonoma hudnervfibrer. För att göra det tog vi 2 mm supraorbital punch hudbiopsier från den drabbade sidan och opåverkad spegelsida hos tio patienter med oftalmisk PHN. Vi behandlade hudproverna med indirekt immunofluorescens, undersökte proverna genom konfokal mikroskopi, framstående epidermal unmyelinerad och dermal myelinerad innervation och beskrev autonom nervfiber involvering.

material och metoder

vi registrerade 10 patienter (3 F, 7 m; 74,5 4,4 xnumx xnumx xnumx år) med oftalmisk PHN vid Institutionen för neurologi, Sapienza University, Rom. Oftalmisk PHN diagnostiserades i enlighet med International Headache Society diagnostic criteria: smärta som kvarstår eller återkommer i minst 3 månader i det område som tillhandahålls av oftalmisk uppdelning av trigeminusnerven och orsakad av herpes zoster. Exklusions kriterier var kognitiv försämring, andra sjukdomar i centrala och perifera nervsystemet. Ingen patient behandlades med aktuella smärtstillande medel (dvs., lidokain och capsaicin).

Institutional Review Board vid Institutionen för neurologi, Policlinico Umberto I, Rom, godkände studien och patienterna gav sitt informerade samtycke.

klinisk och neurofysiologisk bedömning

alla deltagare genomgick en allmän undersökning och en neurologisk undersökning, med fullständig sensorisk testning inklusive negativ (taktil, pinprick och termisk hypoestesi) och positiva symtom (pågående spontan smärta, paroxysmal smärta) och tecken (mekanisk dynamisk allodyni och pinprick hyperalgesi). Närvaron och svårighetsgraden av negativa symtom bedömdes genom att jämföra den drabbade sidan med spegelbilden på den friska sidan. Svårighetsgraden av de olika smärttyperna (dvs. pågående spontan smärta, paroxysmal smärta, mekanisk dynamisk allodyni, pinprick hyperalgesi) bedömdes på en 0-10 numerisk betygsskala (NRS; 0 = ingen känsla, 10 = värsta möjliga smärta).

hos alla patienter registrerade vi den a-Mieliniserade Fibermedierade blinkreflexen, med metoder som följde rekommendationerna från International Federation of Clinical Neurophysiology guidelines (Deuschl och Eisen, 1999). För att undersöka en Fiberfunktion från C och C spelade vi in laser framkallade potentialer, enligt en tidigare rapporterad teknik (Truini et al., 2008).

hudbiopsi

två mm punch hudbiopsier togs omedelbart ovanför ögonbrynet från den drabbade och opåverkade spegelsidan. Såret läkte om några dagar utan synligt ärr (Figur 1). Hudprover behandlades med immunhistokemiska tekniker, som tidigare beskrivits (Nolano et al., 2013). Prover fixerades över natten i Zamboni-lösning, kryoskyddades i 20% sackaros i fosfatbuffrad saltlösning och skars i 50-sekgm-tjocka sektioner på en frysande mikrotom (Leica 2000r, Tyskland). Fritt flytande sektioner bearbetades för indirekt immunofluorescens med användning av en antikroppspanel för att fläcka sensorisk, autonom hud innervation och vaskulära strukturer, inklusive PGP9.5, kalcitoningenrelaterad peptid (CGRP), substans P (SubP) och vasoaktiv tarmpeptid (VIP) antikroppar (Tabell 1). Digitala bilder förvärvades med icke-laser konfokal mikroskopi (CARV confocal system; Atto Biosciences, USA och Apotome confocal system; Zeiss, Tyskland).

Figur 1. Två mm supraorbital punch hudbiopsi. (A) fotografi av en patient med postherpetisk neuralgi (PHN) som visar 2 mm hudsår omedelbart efter stansen. (B) efter 1 vecka är ärret knappast synligt.

tabell 1. Förkortning, källa och utspädning av immunhistokemiska markörer.

enf-densitet bedömdes i 2-mm hudstansbiopsiproverna genom att applicera Neurolucida-programvara (MicroBrightField Bioscience, USA) till fyra konfokala bilder i 20 cu-serien i Z-serien (2 Cu-steg 16), erhållna från fyra slumpmässigt valda sektioner för varje prov. Dermala myeliniserade nervfibrer kvantifierades med användning av anti-myelin basiska proteinantikroppar i hela hudytan inklusive 1 mm Djup från källarmembranet i tre slumpmässiga sektioner för varje prov, efter tidigare publicerad procedur (Nolano et al., 2013). Ett kalibrerat RUTNÄT (2 1 mm ci) med en serie på sju parallella linjer på samma avstånd applicerades på en digital icke-konfokal bild av originalförstoringen av myelin basiska proteinfärgade sektioner. Alla avlyssningar mellan myelinerade fibrer och rutnätet räknades. Dermal myelinerad nervfiberdensitet beräknades som antalet fibrer som avlyssnar gallret per dermal område (avlyssningar per mm2). En enda operatör kvantifierade blint hudnervfiber i varje prov. VIP-ir sudomotor nervlängdstäthet (nm/mm3) beräknades med hjälp av nervspårningsmodulen Autoneuron, en del av Neurolucida-programvaran , som tidigare beskrivits (Provitera et al., 2014). För att bedöma peptidergiska fibrer (SubP, CGRP och VIP-ir) i den subepidermala neurala plexusen, inom 100 CGM från källarmembranet, applicerades en semikvantitativ poäng (0 = frånvaro av fibrer, 1 = sällsynta fibersegment, kortare än 10 CGR, 2 = få fibrer, som i stor utsträckning fyller denerverade dermis, 3 = normala, flera fibrer som täcker de flesta av subepidermala neurala plexuserna).

Hudbiopsifynd hos de 10 patienterna jämfördes med ett matchat prov av 10 friska försökspersoner (epidermal nervfiberdensitet: 18,9 3,7 xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx mm; Nolano et al., 2013).

statistisk analys

Alla data uttrycks som medelvärde för SD-kort. Normal fördelning av epidermal och dermal myelinerad fiberdensitet utvärderades med användning av D ’ Agostino och Pearson omnibus normalitetstest. Wilcoxon matched-pair-testet användes för att jämföra neurofysiologiska och hudbiopsivariabler mellan opåverkade och drabbade sidor. Mann Whitney-testet användes för att jämföra hudbiopsivariabler mellan PHN-patienter och normala kontroller. Korrelationer mellan ENF-densiteten och PHN-varaktigheten beräknades med Pearsons r-korrelationskoefficient. P-värden mindre än eller lika med 0,05 ansågs indikera statistisk signifikans.

resultat

vid klinisk undersökning klagade alla tio patienter på sensoriska underskott som involverade alla sensoriska modaliteter och rapporterade pågående spontan smärta (NRS: 4,3 kg 1,4); fem patienter klagade också på mekanisk dynamisk allodyni (NRS: 3,5 kg 0,7).

neurofysiologisk testning visade allvarliga avvikelser som involverade alla testade variabler. Hos alla patienter framkallade en blink-reflex som stimulerade den drabbade sidan, onormala (fördröjda eller frånvarande) svar. Laserperceptiva trösklar var högre och en C – laser framkallade potentiella amplituder lägre efter stimulering av den drabbade sidan än efter stimulering av den opåverkade sidan (p < 0,05, Wilcoxon test). Hos 2 av de 10 patienterna var laser framkallade potentialer relaterade till C-fiberstimulering frånvarande också på den opåverkade sidan (Tabell 2).

tabell 2. Förkortning, källa och utspädning av immunhistokemiska markörer.

konfokal immunofluorescensanalys visade att hudinervering i supraorbital punch hudbiopsier från patienter med PHN skilde sig slående mellan de opåverkade (figurerna 2a,C,E) och drabbade sidor (figurerna 2b,D,F). Medan hudbiopsiprover från den opåverkade sidan visade en ganska tät och regelbunden innervering, verkade epidermis i den drabbade sidan dåligt och ojämnt innerverade med kluster och långa områden utan nervfibrer (figurerna 2a–D). Semikvantitativ analys visade att subepidermal plexus dök upp fattig och sjuklig, och jämfört med den opåverkade sidan, innehöll mindre (p < 0.001) CGRP (1.4 ± 0.8 vs 2.5 ± 0.5), SubP (1.1 ± 0.6 vs. 2.3 ± 0.7) och VIP (1.0 ± 0.7 vs. 2.2 ± 0.8) immunoreaktiva (IR) nervtrådar. Hårsäckar verkade dåligt innerverade med få omyeliniserade och myeliniserade fibrer (figurerna 2F,E). Epidermal och dermal myelinerad fiberförlust varierade från måttlig till svår och 3 av de 10 patienterna hade fullständig huddenervering. De få överlevande epidermala axonerna grupperades mellan områden av denerverad epidermis. Myeliniserade fibrer visade flera morfologiska abnormiteter, såsom fragmentering, frekvent förekomst av längre nodal längd än normalt (7 kg eller längre; Nolano et al., 2003) och kaliber oegentligheter med utvidgning och krympning (förändring i diameter över 100%) inom samma internod. Dessa egenskaper observerades sällan i den opåverkade sidan. I motsats till sensorisk innervation verkade båda komponenterna, adrenerga och kolinerga, av autonom innervation till de dermala bilagorna relativt bevarade (Figur 3). De opåverkade och drabbade sidorna visade många kolinerga (VIP-ir) sudomotor (figurerna 3C,D) och adrenerga (DbH-ir) pilomotor (figurerna 3E,F) fibrer. Kolinerg sudomotorisk nervfiberdensitet skilde sig inte mellan drabbade (1,9 ml 0.7 nm / mm3) och opåverkad sida (2,0 0,5 Nm/mm3).

Figur 2. Hud innervation. Konfokala bilder som visar hudinervering i den opåverkade (A,C,E) och drabbade sidan (B,D, F) hos en representativ patient med PHN. Allvarlig epidermal och dermal nervfiberförlust är synlig i hudbiopsiprover från den drabbade sidan (B vs. a). Epidermis i den drabbade sidan visar en lång kanal utan nervfibrer och nervfiberkluster (D vs. C). Slående omyeliniserad och myelinerad nervfiberförlust runt hårsäckar (F vs. E). Barer: 100 C / M i (A, B, E, F); 25 C / M i (C,D).

Figur 3. Autonom hud innervation. Konfokala bilder som visar autonom innervation till dermala bilagor i den drabbade (A,C,E) och opåverkad sida (B,D,F). Den övre dermis runt hårsäckar i den drabbade sidan innehåller färre vasoaktiva intestinala peptid-immunoreaktiva (VIP-IR) fibrer än samma dermala område i den opåverkade sidan (A vs. B) medan VIP-ir sudomotor och DBH-ir pilomotor innervation är väl utrustad (D och F vs. C och E). Barer: 100 kg i (A, B); 50 kg i (C,D), 25 kg i (E,F).

kvantitativ analys (baserad på analys av pgp9.5 och Myelin basisk protein (MBP) immunoreaktivitet) av hudbiopsiproverna visade en signifikant lägre epidermal och dermal myeliniserad fiberdensitet i den drabbade sidan än i den opåverkade sidan (3,1 3,3 och 2,1 2,8 2,8 vs. 17,2 8,9 och 6,6 5,0/mm2; p < 0,01, tabell 2). Förhållandet mellan epidermala och dermala myeliniserade nervfibrer var signifikant lägre i de drabbade än i den opåverkade sidan (1,1 ml 1,0 vs. 4.3 5,3; p < 0,01).

Även om enf-densiteten ökade med PHN-varaktigheten, kunde denna korrelation inte nå statistisk signifikans (r: 0,5574, p = 0,09; Figur 4).

Figur 4. Korrelation mellan epidermal nervfiber (enf) densitet och PHN-varaktighet. Även om enf-densiteten ökade med PHN-varaktigheten missade denna korrelation den statistiska signifikansen (epidermal nervfiber: r: 0,5574, p = 0,09).

medelvärdena för omyeliniserade och myeliniserade nervfiberdensiteter på den opåverkade sidan skilde sig inte från kontrollerna (epidermal nervfiberdensitet: 17, 2 8, 9/mm vs. 18, 9 3, 7/mm; dermal myelinerad fiberdensitet: 6, 6 5, 0/mm vs. 6, 7 1, 4/mm; p > 0.3, av Mann-Whitney test). Men hos de två patienterna med onormal C-fibermedierad laser framkallade potentialer visade hudbiopsi en epidermal och en dermal myelinerad nervfiberförlust också i den opåverkade sidan (0,8 och 3,6/mm i opåverkade och 0,0 och 0.3 / mm i den drabbade sidan).

diskussion

vår kliniska och morfometriska studie, bedöma hud innervation i supraorbital punch hudbiopsier med indirekt immunofluorescens och konfokal mikroskopi, ger ny information som anger att även om oftalmisk PHN påverkar både epidermala omyeliniserade och dermala myeliniserade nervfibrer, skadar det övervägande omyeliniserade nervfibrer och sparar autonom hud innervation.

klinisk undersökning visade att alla patienter hade taktil, pinprick och varm hypoestesi. Följaktligen var alla de tre neurofysiologiska variablerna vi spelade in (den Ajci-fibermedierade blinkreflexen, Ajci – och C-laser framkallade potentialer) onormala. Medan klinisk bedömning och neurofysiologisk testning visade både myeliniserad och omyeliniserad fiberskada, specificerade hudbiopsibedömning att PHN-relaterad skada på hudinervering skilde sig åt i myeliniserade och omyeliniserade fibrer. Mer specifikt föreslår det lägre omyeliniserade / myeliniserade förhållandet i den drabbade sidan än i den opåverkade spegelsidan en övervägande epidermal omyeliniserad nervfiberförlust. Detta nya morfometriska fynd överensstämmer med tidigare studier som undersökte epidermal innervation ensam och visade en variabel omyeliniserad fiberförlust (Oaklander, 2001; Petersen et al., 2010; Reda et al., 2013). Den dominerande omyeliniserade nervfiberinvolveringen som vi beskriver hos patienter med PHN passar in i deras typiskt pågående smärta. Denna typ av smärta återspeglar förmodligen sekundära neuroplastiska förändringar och spontan hyperaktivitet i de anatomiskt denerverade andra ordningens nociceptiva neuroner (Truini et al., 2013). På grund av det lilla studieprovet kunde vi inte på ett tillförlitligt sätt undersöka möjliga samband mellan smärta och kliniska, neurofysiologiska och morfologiska abnormiteter. Denna fråga förtjänar utredning i en ytterligare studie som registrerar fler patienter.

i denna hudbiopsistudie, med indirekt immunofluorescens och konfokal mikroskopi, ger vi tidigare orapporterad detaljerad information om hudens autonoma innervation hos patienter med oftalmisk PHN. Medan autonom innervation till svettkörtlar och erector pilorum muskler skonades, observerade vi en dålig representation av VIP-IR-fibrer i övre dermis, runt kärl och hårsäckar, där det också fanns en dålig representation av CGRP och SubP. Några av dessa fibrer modulerar hårfollikelfunktionen och ansiktsvasomotorisk kontroll och kan härröra från den sensoriska trigeminusnerven (Izumi, 1995, 1999). Detta ursprung kan förklara deras engagemang i PHN medan de oinvolverade sudomotoriska och pilomotoriska VIP-IR-nervfibrerna troligen härrör från de överlägsna cervikala sympatiska ganglierna och från kraniala parasympatiska nerver som PHN lämnar intakta. Med tanke på att många studier tyder på att det autonoma nervsystemet kan delta i utvecklingen av smärta (Fields et al., 1998), den autonoma nervfibersparande som vi beskriver här kan stödja den föreslagna indirekta kopplingen mellan intakta sympatiska postganglioniska och skadade primära afferenta omyeliniserade neuroner (Drummond et al., 2014).

hos våra patienter med oftalmiska PHN-hudbiopsifynd visade att de få överlevande axonerna i den drabbade sidan var grupperade mellan områden av denerverad epidermis och att ENF-densiteten tenderade att öka med sjukdomsvaraktighet. Denna observation leder oss till antagandet att huden kan genomgå en viss nervombyggnad över tiden. Dessa förändringar kan äga rum när de överlevande axonerna groddar säkerheter i ett försök att ockupera det denerverade territoriet. Denna anatomiska ombyggnad kan också medföra en viss funktionell förbättring. Visserligen argumenterar vår hypotes som tyder på en partiell reinnervation över tiden hos patienter med oftalmisk PHN mot pivotala studier som behandlar bröstkorgs PHNS naturhistoria (Petersen et al., 2010; Reda et al., 2013). Dessa studier med funktionella åtgärder och hudbiopsi drar slutsatsen att även vid 7, 7 år finns det bara en blygsam återhämtning av sensorisk funktion och ingen anatomisk återhämtning trots smärtupplösning hos majoriteten av patienterna. I synnerhet visade studien av Reda och kollegor att även om smärta och de flesta mått på sensorisk funktion, sensoriska symtom och capsaicinsvar fortsatte en trend mot förbättring under en långsiktig uppföljning, upplevde många ämnen fortfarande sensoriska avvikelser. Även om vi inte kan utesluta att tillförlitligheten i våra resultat kan påverkas av det lilla urvalet av patienter, är det fortfarande en intressant fråga för framtida forskning om trigeminala systemet, ett märkligt territorium.

den genomsnittliga epidermala och dermala myeliniserade fiberdensiteten och deras förhållande i den opåverkade spegelsidan skilde sig inte från kontrollerna. Men i två av de tio patienterna vi studerade var C-fiberrelaterad laser framkallade potentialer frånvarande efter stimulering av den opåverkade sidan och båda patienterna hade mild epidermal fiberförlust, men mindre allvarlig hos de opåverkade än i den drabbade sidan. Detta resultat är i linje med tidigare kliniska, neurofysiologiska och hudbiopsistudier som visar bilateral nervfiberskada och stöder hypotesen att PHN ibland kan orsaka mild, subklinisk sensorisk afferent pathway involvering i den opåverkade sidan (Haanp Michai et al., 1997; Oaklander et al., 1998; Truini et al., 2008).

vår hudbiopsistudie som visar att oftalmisk PHN differentiellt påverkar epidermala och dermala myeliniserade fibrer och sparar den autonoma hudinervationen ger ny information för att förstå mekanismerna bakom detta inaktiverande tillstånd.

Författarbidrag

intressekonflikt uttalande

författarna förklarar att forskningen genomfördes i avsaknad av kommersiella eller finansiella relationer som kan tolkas som en potentiell intressekonflikt.

fotnoter

1. ^ http://www.ihs-classification.org/_downloads/mixed/International-Headache-Classification-III-ICHD-III-2013-Beta.pdf