skivdegenerering är ett vanligt tillstånd med en komplex multifaktoriell etiologi. 1 låggradig infektion har föreslagits som en orsak till skivdegenerering med Propionibacterium akne identifierad hos 84% av patienterna med skivbråck och ischias med serologi och kulturer. 2 molekylära förändringar har också observerats såsom ökad produktion av kataboliska enzymer (katepsin, lysozym och flera matrismetalloproteinaser) och inflammatoriska cytokiner. 3 unga patienter med ländryggen diskbråck visade sämre återhämtning efter operationen när de hade uppvisat förhöjda serumkoncentrationer av högkänsligt C-reaktivt protein (hs-CRP) preoperativt. Det är emellertid inte klart om höga nivåer av CRP och inflammatoriska cytokiner indikerar en lokal infektion eller ett inflammatoriskt svar på skivbråck. 4

patogener som Parvo-virus B19 eller Epstein Barr-Virus (EBV) spelar en viktig roll i patogenesen av olika former av artrit. 5,6 herpesvirus är en mångfaldig familj av stora DNA-virus, som alla kan skapa livslånga latenta infektioner. Primär infektion med många av dessa virus är vanligt under barndomen. 7,8

denna studie syftade till att undersöka den potentiella rollen av herpesvirus, Herpes Simplex Virus typ-1(HSV-1), Herpes Simplex Virus typ-2 (HSV-2) och Cytomegalovirus (CMV), i patogenesen av degenerering av intervertebral skiva. En molekylär analys av intervertebrala skivprover erhållna under discektomi visade en avsevärd frekvens av CMV och HSV-1 DNA i degenererade skivor, vilket tyder på att virusinfektioner kan vara en viktig faktor i etiologin för denna sjukdom.

patienter och metoder

totalt 16 på varandra följande patienter som genomgick discektomi inom sex månader efter ryggradens diskbråck studerades. Det fanns åtta män och åtta kvinnor med en medelålder på 40,38 år (17 till 65). Studien hade etiskt godkännande. Diagnosen av lumbar skivbråck fastställdes genom fysisk undersökning och Mr. För att tillhandahålla en kontrollgrupp erhölls skivprover perkutant från två patienter med thoracolumbar burstfrakturer som genomgick operation. Dessa patienter genomgick också MR-undersökning preoperativt för att utesluta samtidig degeneration. Arten av de prover som testades i denna studie tillät inte inkludering av fler intervertebrala skivor från friska individer av etiska skäl, medan alternativet av kadaveriska prover som kontroller övergavs eftersom majoriteten av den vuxna befolkningen har en historia av ryggsmärta och skivdegenerering.

förutom materialet från den hernierade skivan som erhölls under discektomi togs ett perifert blodprov från varje patient. Vävnadsprover placerades i steriliserad polypropen 1.5 ml rör och lagrats vid -80 C C tills DNA / RNA-extraktion och polymeraskedjereaktion/ kvantitativ polymeraskedjereaktion (PCR/qRT-PCR) utfördes. Detekteringen av HSV-1 och CMV, IgM+ och IgG+ antikroppar från plasma utfördes med användning av en standard enzymimmunanalys.

DNA / RNA-extraktion.

genomiskt DNA och totalt RNA extraherades från vävnadsproverna med användning av NucleoSpin Tissue XS kit och NucleoSpin RNA XS kit (Macherey-Nagel GmbH och Co., D jacobren, Tyskland), enligt tillverkarens instruktioner. Det renade RNA behandlades vidare med DNaseI för att undvika DNA-kontaminering. DNA-och RNA-provkoncentrationer bestämdes med användning av en spektrofotometer (260 nm) före PCR-amplifiering eller qRT-PCR.

detektion av herpesvirus DNA.

Vi testade åtta olika herpesvirus (HSV-1/-2, Varicella zostervirus (VZV), EBV, CMV, humana herpesvirus 6, 7 och 8 (HHV6, HHV7 och HHV8)) med hjälp av RhyMA Test-Herpes Screening enligt tillverkarens instruktioner (Euroclone, Pavia, Italien). RhyMA-testet baserades på den omvända Hybridiseringstekniken som involverade multiplex DNA-amplifiering med PCR med specifika biotinylerade primers, följt av hybridisering av de förstärkta och biotinylerade DNA-fragmenten med remsor på prober, specifika för var och en av herpesviruset. En slutlig utvecklande reaktion med användning av ett biotin-streptavidin-system krävdes för utvärderingen av resultaten. Positiva och förstärkningskontroller inkluderades också i varje remsa. För tolkningen av resultaten var den utvecklade remsan av varje prov i linje med en standardtabell. RhyMA Test-Herpes Screening är licensierad för in vitro-diagnostisk användning, som intygar analysens höga specificitet och känslighet. För att verifiera de resultat som erhölls med användning av RhyMA Test-Herpes screeninganalys kördes PCR-produkterna också i en 3% lågsmältande agarosgel som producerade det förväntade elektroforetiska mönstret för varje virus. Slutligen utsattes de PCR-positiva proverna för direkt sekvenseringsanalys, vilket bekräftade resultaten erhållna med användning av RhyMA-testet-Herpes screeninganalys.

HSV-1 och CMV qRT-PCR.

totalt RNA transkriberades omvänd med hjälp av RETRO-script kit (Ambion Inc., Austin, Texas, USA) med slumpmässiga hexamer primers. cDNA testades för mallkvalitet genom att konstruera standardkurvor med seriella utspädningar av varje cDNA som mallar i qRT-PCRs. CDNA-mallarna gav en analyseffektivitet på 90% till 105% och R2 för alla standardkurvor var > 0.98. Efter omvänd transkription förstärktes cDNA med användning av ICP0-och IE1-specifika primers för kvantifiering av HSV-1 respektive HCMV-mRNA, som tidigare beskrivits. 9,10

alla qRT-PCR utfördes i tre exemplar med Maxima SYBR Green qPCR master mix (Fermentas Inc., Glen Burnie, Maryland) i en Abi PRISM 7500 Sekvensdetektor (PE Biosystems, Foster City, Kanada), inklusive de extraherade RNA-proverna samt positiva och negativa kontroller. SYBR grön fluorescens mättes under loppet av 40 förstärkningscykler. För varje kvantifierad Mall beräknades det genomsnittliga cykelnumret vid vilket produktackumulering gick in i linjärt intervall (CT). Replikera CT-värden var inom 0,4 cykler av varandra. 18SRRNA CT-värdet för en given mall subtraherades från CT som erhölls för varje mRNA av intresse (ICP0 och IE1) från samma mall för att erhålla det normaliserade CT-värdet (AUDCT) för varje mall.

tumörnekrosfaktor-ci och Interleukin-6-genuttryck.

för kvantifiering av TNF-Kubi eller IL-6 mRNA användes 1 cDNA-cDNA tillsammans med primrarna som visas ovan i en 20-reaktion med SYBR green som markör för DNA-innehåll. De primers som användes var: beta aktin: framåt: 5 ’- TCAGAAGAACTC CTA TGT GG-3’, omvänd: 5 ’-TCT CTT TGA TGT CAC GCA CG-3’; TNF-a framåt: 5 ’- CAC GCT CTT CTG TCT ACT GAA CTT CG-3′, omvänd: 5′-GGC TGG GTA GAG AAT gga TGA ACA CC-3′, 11 IL-6: framåt: 5′-ACA GCC ACT CAC CTC TTC AG -3′, omvänd: 5′ – GTG CCT CTT TGC TGC TTT CAC -3’. 12 inga biprodukter förekom i reaktionen såsom indikeras av dissociationsmönstret som tillhandahölls i slutet av reaktionen och genom agarosgelelektrofores (data visas inte). Amplifieringseffektiviteten hos TNF-Kubi och IL-6-produkterna var desamma som för beta-aktin, vilket indikeras av standardkurvorna för förstärkning, vilket gör att vi kan använda formeln: faldig ökning = 2-(Ubisct a-Ubisctb). Reaktioner utfördes i tre exemplar för att möjliggöra statistisk utvärdering.

resultat

en PCR-omvänd hybridiseringsanalys användes för att undersöka DNA från åtta olika herpesvirus i de intervertebrala skivproverna hos patienter med skivbråck (Fig. 1). Herpesvirus DNA detekterades i 13 av 16 prover (81, 25%). HSV – 1 presenterade den högsta prevalensen hos nio patienter (56,25%), medan CMV upptäcktes hos sex patienter (37,5%) (tabell i). Två patienter var samtidigt infekterade med både HSV-1 och CMV. DNA från HSV-2, VZV, EBV, HHV6, HHV7 och HHV8 detekterades inte i skivproverna från någon av patienterna. Ingen av kontrollpatienterna (C1 och C2) testade positivt för närvaron av herpesvirus DNA (Fig. 1).

statusen för HSV-1 och CMV-infektion, i de intervertebrala skivproverna undersöktes genom att undersöka det potentiella uttrycket av virala transkript genom realtid qRT-PCR. Herpesvirusgenuttryck detekterades inte i något av de testade proverna, vilket visade frånvaron av en aktiv virusinfektion, vilket tyder på etablering av latent herpesvirusinfektion i dessa prover.

patienternas seropositivitet undersöktes också. Alla HSV-1-eller CMV PCR-positiva patienter presenterade IgG+ – antikroppar för samma virus (tabell i). I tre fall för HSV-1 och i sex fall för CMV detekterades IgG+ antikroppar utan samtidig prevalens av viralt DNA. Vidare var HSV-1-och CMV IgM+ – antikropparna från perifert blod negativa hos alla patienter, vilket indikerar att ingen av patienterna hade upplevt en akut herpesvirusinfektion vid tidpunkten för kirurgisk excision.

bortsett från den makroskopiska indikationen på inflammation som omger den hernierade skivan, fick vi också experimentella bevis på inflammation i de intervertebrala skivproverna genom att undersöka mRNA-nivåerna av TNF-Kubi och IL-6, i alla prover med qRT-PCR. Analysen visade ungefär två till trefaldig ökning av båda inflammatoriska markörerna i proverna jämfört med kontrollerna (Fig. 2). Intressant nog visade de patienter som var saminfekterade av både HSV-1 och CMV de högsta nivåerna av TNF-Kubi och IL-6. Dessutom uppvisade två av tre patienter (patienter 2 och 8) utan tecken på virusinfektion lägre nivåer av TNF-Kubi. Denna negativa korrelation hittades inte för IL – 6-nivåer hos dessa patienter.

diskussion

föreliggande studie föreslår konceptet att herpesvirusinfektion kan främja skivdegenerering. Vi kunde upptäcka HSV-1 och CMV-DNA i ett stort antal humana intervertebrala skivprover skördade under discektomi.

tidigare låggradig infektion har föreslagits som en möjlig orsak till skivdegenerering. 2,4 flera författare har betonat sambandet mellan modic typ 1-signaler (ökad marvsignalintensitet i T2-viktade MR-bilder och minskad signalintensitet i T1-viktade MR-bilder och fibrovaskulär vävnad i ändplattorna) och infektion. 13,14 om patienterna inte har svår ryggsmärta, temperatur eller en onormal blodprofil är det svårt att skilja mellan modic 1-förändringar och låggradig infektion. 13,14

förhållandet mellan virusinfektion och apoptos har undersökts i stor utsträckning, vilket klargör mekanismerna för apoptosinduktion av virus. 15,16 det är nu känt att Parvovirus B19 och särskilt dess ns-1-protein, har en potent cytotoxisk effekt på värdcellerna och orsakar apoptos i de infekterade cellerna. 17 virus spelar en roll i patogenesen av olika former av artrit. Stahl et al 5 detekterade viralt DNA från flera virus i synovialvävnad som tagits från patienter med tidig artrit. En ny studie föreslog att de avancerade stadierna av artros kan vara relaterade till ökad inflammation och skada på ledbrosk på grund av Parvovirus B19. 18 i en annan studie föreslogs att humant Parvovirus B19 är involverat i initiering och förvaring av synovit vid reumatoid artrit, vilket leder till ledskador under överdriven syntes av inflammatoriska cytokiner och proteolytiska enzymer. 19

HSV-1-infektioner är endemiska över hela världen. Över 90% av vuxna har antikroppar mot HSV-1 under det femte decenniet. Herpesvirus är allestädes närvarande patogener hos barn, som förblir latenta efter en aktiv infektion. 20,21 under infektionens initiala fas sker viral replikation i ganglier med överlevnad av vissa celler som upprätthåller viralt genom kompatibelt med normal cellulär funktion. Denna fina balans mellan värdceller och viruset kan störas av olika stimuli, vilket leder till reaktivering. 22

i vår studie hade ingen av patienterna upplevt akut herpesinfektion. Detta var uppenbart både på serologisk nivå på grund av frånvaro av IgM+ antikroppar från perifert blod, såväl som på molekylär nivå på grund av bristen på virala mRNA-transkript från skivproverna. Således kan den höga förekomsten av HSV-1-infektion i barndomen, liksom dess retention i nervsystemet, erbjuda en tillfredsställande förklaring av närvaron av både HSV-1 och CMV i den intervertebrala skivan.

frågan uppstår hur virusen kommer in i det intervertebrala skivutrymmet. Det är väl etablerat att stora kärlkanaler korsar ändplattorna under tidigt fosterliv, som därefter minskar med födseln och helt försvinner vid åldern fyra till sex år, vilket gör skivan till en av de största avaskulära vävnadstyperna i kroppen. 23 man kan spekulera i att närvaron av viralt DNA i den intervertebrala skivan är sekundär till migrering av makrofager eller andra celler som innehåller viralt DNA i skivan under barndomen medan skivmiljön fortfarande är rik på blodkärl. Andra mekanismer kan också spela en roll eftersom det är välkänt att herpes simplex-viruset kan aktiveras i neuronala axoner av inflammatoriska cytokiner, såsom IL-1 och TNF-Kubi 24,25 Och genom antidromal migration kan involvera skivutrymmet.således aktiverar den inflammerade eller skadade skivan, som producerar en mängd proinflammatoriska cytokiner, latenta virus. Dessa mekanismer kan också förklara närvaron av DNA från två eller flera virus i skivproverna. Även om närvaron av virus är ett sekundärt fenomen kan deras närvaro bidra till patogenesen av degenerering av intervertebral skiva eftersom virala antigener ytterligare förbättrar skivförsämringen genom aktivering av den inflammatoriska miljön vilket underlättar aktiverade makrofager och andra celler för att orsaka vävnadsskada.

i vår studie avslöjade intraoperativ bedömning av det kirurgiska fältet makroskopiska bevis på inflammation kring den hernierade skivan. Beviset på inflammationen i skivproverna och bidraget från virusinfektion till förbättringen av den inflammatoriska processen kom från analysen av mRNA-nivåerna av välkända gener, som är associerade med inflammation, såsom TNF-Kubi och IL-6. Båda inflammatoriska markörer visade ungefär två till tre gånger högre nivåer i patienternas prover jämfört med kontrollerna. Intressant var att proverna som saminfekterades av både HSV-1 och CMV uppvisade de högsta nivåerna av TNF-Kubi och IL-6, vilket tyder på en synergistisk effekt av virusen. Dessutom var halterna av TNF-Kubi lika låga som kontrollfallen bland patienterna där vi inte kunde upptäcka viralt DNA.

en nyligen recenserad artikel säger att skivdegenerering inte är en diagnos utan ett uttryck för skivans tillstånd, vilket är resultatet av flera faktorer som verkar, individuellt eller kollektivt. 1 i stället för att vara resultatet av en enda process kan skivdegenerering ha ett antal möjliga orsaker, inklusive mekanisk, åldrande, genetisk, systemisk, giftig och/eller infektion. Frånvaron av viral detektion hos alla våra 16 patienter överensstämmer med multifaktoriell orsakssamband av skivprolaps. Det är känt att genetiska faktorer producerar onormala komponenter i matrisen 26-28 som äventyrar skivans struktur och funktion och ökar skivvävnadens mottaglighet för mekanisk stress. 29 epidemiologiska studier har visat att genetiska faktorer ökar risken för degeneration, 30-35 men de tar inte hänsyn till alla fall, 28,36 med variationer över olika etniska populationer 37 så att stora multietniska befolkningsstudier krävs. 38

närvaron av virusen på skivan kan skapa en inställning där skivan är sårbar för skador genom mekanisk stress och trauma. Det är troligt att viralt DNA skulle vara närvarande vid intervertebrala skivnivåer men de mekaniska påfrestningarna som postuleras för att bidra till degenerationen sker på lumbosakralnivå där problem är mycket vanligare. 1 låggradig infektion, med eller utan genetiskt inflytande, kan öka känsligheten hos den intervertebrala skivan för miljöfaktorer, vilket sekundärt driver de biologiska händelserna som resulterar i skivdegenerering. Eventuellt herpes DNA fungerar som en faktor som förändrar matrisens strukturella egenskaper i skivan genom att modulera apoptos och lokalt inflammatoriskt svar, vilket tyder på att virusinfektion eller reaktivering är associerad med sjukdomen.upptäckten av Marshall och Warren 39 att infektion med Helicobacter pylori var ansvarig för utvecklingen av magsår ledde till ett stort skifte i medicinsk förståelse. Möjligheten att en smittsam process kan bidra till skivdegenerering bör övervägas allvarligt.

Vi tror att detta är den första studien som dokumenterar förekomsten av herpesvirus i den intervertebrala skivan hos patienter med skivbråck. Ytterligare studier är nödvändiga för att bestämma de underliggande mekanismerna och stödja herpesvirusens potentiella roll i patogenesen av degenerativ skivsjukdom.

inga förmåner i någon form har mottagits eller kommer att tas emot från en kommersiell part som direkt eller indirekt är relaterad till ämnet i denna artikel.