La PGD è una forma di diagnosi genetica eseguita prima dell’impianto. Ciò implica che gli ovociti del paziente devono essere fecondati in vitro e gli embrioni tenuti in coltura fino a quando non viene stabilita la diagnosi. È inoltre necessario eseguire una biopsia su questi embrioni al fine di ottenere materiale su cui eseguire la diagnosi. La diagnosi stessa può essere eseguita utilizzando diverse tecniche, a seconda della natura della condizione studiata. Generalmente, metodi basati su PCR sono utilizzati per disturbi monogenici e PESCE per anomalie cromosomiche e per sessuare quei casi in cui non è disponibile alcun protocollo PCR per una malattia legata all’X. Queste tecniche devono essere adattate per essere eseguite su blastomeri e devono essere accuratamente testate su modelli unicellulari prima dell’uso clinico. Infine, dopo la sostituzione dell’embrione, gli embrioni non affetti di buona qualità in eccesso possono essere crioconservati, scongelati e trasferiti in un ciclo successivo.

Ottenere embriosEdit

Attualmente, tutti gli embrioni PGD sono ottenuti con la tecnologia di riproduzione assistita, anche se l’uso di cicli naturali e fecondazione in vivo seguita da lavaggio uterino è stato tentato in passato ed è ora in gran parte abbandonato. Al fine di ottenere un grande gruppo di ovociti, i pazienti sottoposti a stimolazione ovarica controllata (COH). COH è realizzata in un agonista protocollo, utilizzando ormone di rilascio delle gonadotropine (GnRH) farmaceutici per la desensibilizzazione ipofisaria, combinato con umana della menopausa gonadotropine (hMG) ricombinante o ormone follicolo stimolante (FSH), o di un antagonista, un protocollo con FSH ricombinante combinato con un antagonista del GnRH secondo la valutazione clinica del profilo del paziente (età, indice di massa corporea (BMI), endocrino parametri). hCG viene somministrato quando almeno tre follicoli di diametro medio superiore a 17 mm sono visibili all’ecografia transvaginale. Il recupero ecoguidato transvaginale degli ovociti è programmato 36 ore dopo la somministrazione di hCG. La supplementazione di fase luteale consiste nella somministrazione intravaginale giornaliera di 600 µg di progesterone naturale micronizzato.

Gli ovociti vengono accuratamente denudati dalle cellule del cumulo, poiché queste cellule possono essere una fonte di contaminazione durante la PGD se viene utilizzata la tecnologia basata sulla PCR. Nella maggior parte dei cicli riportati, l’iniezione intracitoplasmatica dello sperma (ICSI) è usata invece di IVF. I motivi principali sono per prevenire la contaminazione con sperma residuo aderito alla zona pellucida e per evitare insuccessi di fecondazione imprevisti. La procedura ICSI viene eseguita su ovociti maturi di metafase-II e la fecondazione viene valutata 16-18 ore dopo. Lo sviluppo dell’embrione viene ulteriormente valutato ogni giorno prima della biopsia e fino al trasferimento nell’utero della donna. Durante la fase di scissione, la valutazione dell’embrione viene eseguita quotidianamente sulla base del numero, della dimensione, della forma cellulare e della velocità di frammentazione dei blastomeri. Il giorno 4, gli embrioni sono stati valutati in funzione del loro grado di compattazione e le blastocisti sono state valutate in base alla qualità del throphectoderm e della massa cellulare interna e al loro grado di espansione.

Procedure bioptichemodifica

Poiché la PGD può essere eseguita su cellule provenienti da diversi stadi di sviluppo, le procedure bioptiche variano di conseguenza. Teoricamente, la biopsia può essere eseguita in tutte le fasi preimpianto, ma solo tre sono stati suggeriti: su ovociti non fecondati e fecondati (per corpi polari, PBs), al terzo giorno embrioni in fase di scissione (per blastomeri) e su blastocisti (per cellule trofectodermiche).

La procedura bioptica prevede sempre due fasi: l’apertura della zona pellucida e la rimozione delle cellule. Esistono diversi approcci per entrambe le fasi, tra cui meccanica, chimica e fisica (soluzione acida di Tyrode) e tecnologia laser per la violazione della zona pellucida, estrusione o aspirazione per la rimozione di PBs e blastomeri e ernia delle cellule trofectodermiche.

Polar body biopsyEdit

Una biopsia del corpo polare è il campionamento di un corpo polare, che è una piccola cellula aploide che si forma contemporaneamente come cellula uovo durante l’oogenesi, ma che generalmente non ha la capacità di essere fecondata. Rispetto a una biopsia di blastocisti, una biopsia del corpo polare può potenzialmente avere costi inferiori, effetti collaterali meno dannosi e più sensibili nel rilevare anomalie. Il vantaggio principale dell’uso di corpi polari nella PGD è che non sono necessari per una fertilizzazione riuscita o un normale sviluppo embrionale, garantendo così nessun effetto deleterio per l’embrione. Uno degli svantaggi della biopsia PB è che fornisce solo informazioni sul contributo materno all’embrione, motivo per cui possono essere diagnosticati casi di disturbi autosomici dominanti ereditati dalla madre e X-linked trasmessi esclusivamente dalla madre, e i disturbi autosomici recessivi possono essere diagnosticati solo parzialmente. Un altro inconveniente è l’aumento del rischio di errore diagnostico, ad esempio a causa della degradazione del materiale genetico o di eventi di ricombinazione che portano a corpi polari eterozigoti.

Biopsia in fase di clivaggio (biopsia blastomerica)Modifica

La biopsia in fase di clivaggio viene generalmente eseguita la mattina del terzo giorno post-fecondazione, quando normalmente gli embrioni in via di sviluppo raggiungono lo stadio a otto cellule. La biopsia viene solitamente eseguita su embrioni con meno del 50% di frammenti anucleati e in uno stadio di sviluppo a 8 cellule o successivo. Un foro è fatto nella zona pellucida e uno o due blastomeri che contengono un nucleo sono delicatamente aspirati o estrusi attraverso l’apertura.Il principale vantaggio della biopsia in fase di scissione rispetto all’analisi PB è che l’input genetico di entrambi i genitori può essere studiato. D’altra parte, gli embrioni in fase di scissione hanno un alto tasso di mosaicismo cromosomico, mettendo in discussione se i risultati ottenuti su uno o due blastomeri saranno rappresentativi per il resto dell’embrione. È per questo motivo che alcuni programmi utilizzano una combinazione di biopsia PB e biopsia blastomerica. Inoltre, la biopsia in fase di scissione, come nel caso della biopsia PB, produce una quantità molto limitata di tessuto per la diagnosi, rendendo necessario lo sviluppo di tecniche di PCR e FISH monocellulari.Sebbene teoricamente la biopsia della PB e la biopsia della blastocisti siano meno dannose della biopsia in fase di scissione, questo è ancora il metodo prevalente. Viene utilizzato in circa il 94% dei cicli di PGD segnalati al Consorzio ESHRE PGD. Le ragioni principali sono che consente una diagnosi più sicura e più completa rispetto alla biopsia PB e lascia ancora abbastanza tempo per completare la diagnosi prima che gli embrioni debbano essere sostituiti nell’utero del paziente, a differenza della biopsia della blastocisti.Di tutte le fasi di scissione, è generalmente convenuto che il momento ottimale per la biopsia è nella fase a otto cellule. È diagnosticamente più sicuro della biopsia del PB e, a differenza della biopsia della blastocisti, consente la diagnosi degli embrioni prima del giorno 5. In questa fase, le cellule sono ancora totipotenti e gli embrioni non si stanno ancora compattando. Sebbene sia stato dimostrato che fino a un quarto di un embrione umano può essere rimosso senza interrompere il suo sviluppo, resta ancora da studiare se la biopsia di una o due cellule è correlata alla capacità dell’embrione di svilupparsi ulteriormente, impiantare e crescere in una gravidanza a termine.

Non tutti i metodi di apertura della zona pellucida hanno lo stesso tasso di successo perché il benessere dell’embrione e/o del blastomero può essere influenzato dalla procedura utilizzata per la biopsia. La perforazione di zona con la soluzione acida di Tyrode (ZD) è stata esaminata rispetto alla dissezione parziale di zona (PZD) per determinare quale tecnica avrebbe portato a gravidanze più riuscite e avrebbe avuto meno effetti sull’embrione e/o sul blastomero. ZD utilizza un enzima digestivo come pronasi che lo rende un metodo di perforazione chimica. Le sostanze chimiche utilizzate in ZD possono avere un effetto dannoso sull’embrione. PZD utilizza un microneedle di vetro per tagliare la zona pellucida che lo rende un metodo di dissezione meccanica che in genere ha bisogno di mani esperte per eseguire la procedura. In uno studio che ha incluso 71 coppie, ZD è stato eseguito in 26 cicli da 19 coppie e PZD è stato eseguito in 59 cicli da 52 coppie. Nell’analisi a singola cella, c’è stato un tasso di successo dell ‘87,5% nel gruppo PZD e dell’ 85,4% nel gruppo ZD. L’età materna, il numero di ovociti recuperati, il tasso di fecondazione e altre variabili non differivano tra i gruppi ZD e PZD. È stato riscontrato che la PZD ha portato a un tasso significativamente più elevato di gravidanza (40,7% vs 15,4%), gravidanza in corso (35,6% vs 11,5%) e impianto (18,1% vs 5,7%) rispetto alla ZD. Ciò suggerisce che l’utilizzo del metodo meccanico di PZD nelle biopsie di blastomeri per la diagnosi genetica preimpianto può essere più abile rispetto all’utilizzo del metodo chimico di ZD. Il successo di PZD su ZD potrebbe essere attribuito all’agente chimico in ZD che ha un effetto nocivo sull’embrione e/o sul blastomero. Attualmente, la perforazione di zona utilizzando un laser è il metodo predominante di apertura della zona pellucida. L’uso di un laser è una tecnica più semplice rispetto all’uso di mezzi meccanici o chimici. Tuttavia, perforazione laser potrebbe essere dannoso per l’embrione ed è molto costoso per i laboratori di fecondazione in vitro da utilizzare soprattutto quando PGD non è un processo prevalente come dei tempi moderni. PZD potrebbe essere una valida alternativa a questi problemi.

Blastocyst biopsyEdit

Nel tentativo di superare le difficoltà legate alle tecniche unicellulari, è stato suggerito di biopsia embrioni allo stadio di blastocisti, fornendo una maggiore quantità di materiale di partenza per la diagnosi. È stato dimostrato che se più di due celle sono presenti nella stessa provetta, i principali problemi tecnici della PCR a cella singola o del FISH scomparirebbero virtualmente. D’altra parte, come nel caso della biopsia in fase di scissione, le differenze cromosomiche tra la massa cellulare interna e il trofectoderma (TE) possono ridurre l’accuratezza della diagnosi, sebbene questo mosaicismo sia stato segnalato per essere inferiore rispetto agli embrioni in fase di scissione.

La biopsia TE ha dimostrato di avere successo in modelli animali come conigli, topi e primati. Questi studi dimostrano che la rimozione di alcune cellule TE non è dannosa per l’ulteriore sviluppo in vivo dell’embrione.

La biopsia umana in fase di blastocisti per la PGD viene eseguita facendo un buco nella ZP il terzo giorno della coltura in vitro. Ciò consente al TE in via di sviluppo di sporgere dopo la blastulazione, facilitando la biopsia. Il quinto giorno dopo la fecondazione, circa cinque cellule vengono asportate dal TE usando un ago di vetro o un’energia laser, lasciando l’embrione in gran parte intatto e senza perdita di massa cellulare interna. Dopo la diagnosi, gli embrioni possono essere sostituiti durante lo stesso ciclo, o crioconservati e trasferiti in un ciclo successivo.

Ci sono due inconvenienti a questo approccio, a causa della fase in cui viene eseguito. Innanzitutto, solo circa la metà degli embrioni preimpianto raggiunge lo stadio di blastocisti. Questo può limitare il numero di blastocisti disponibili per la biopsia, limitando in alcuni casi il successo della PGD. Mc Arthur e colleghi riferiscono che il 21% dei cicli di PGD iniziati non aveva un embrione adatto alla biopsia TE. Questa cifra è circa quattro volte superiore alla media presentata dai dati del consorzio ESHRE PGD, dove PB e biopsia in fase di scissione sono i metodi segnalati predominanti. D’altra parte, ritardare la biopsia a questa fase avanzata dello sviluppo limita il tempo per eseguire la diagnosi genetica, rendendo difficile rifare un secondo ciclo di PCR o reibridizzare le sonde di PESCE prima che gli embrioni vengano trasferiti di nuovo al paziente.

Campionamento delle cellule del cumulomodifica

Il campionamento delle cellule del cumulo può essere eseguito in aggiunta a un campionamento di corpi polari o cellule dall’embrione. A causa delle interazioni molecolari tra le cellule del cumulo e l’ovocita, la profilazione dell’espressione genica delle cellule del cumulo può essere eseguita per stimare la qualità degli ovociti e l’efficienza di un protocollo di iperstimolazione ovarica e può indirettamente prevedere l’aneuploidia, lo sviluppo embrionale e gli esiti della gravidanza.

Metodi non invasivi di screening genetico preimpianto (NIPGS)Modifica

La biopsia embrionale tradizionale può essere invasiva e costosa. Pertanto, i ricercatori hanno una ricerca continua per trovare metodi meno invasivi per i test genetici preimpianto. Studi su nuovi metodi di screening non invasivi della genetica preimpianto (NIPG) come blastocoel fluid e outdoing embryo media sono stati recentemente pubblicati come alternativa ai metodi tradizionali

Test di screening genetico preimpianto utilizzando Blastocoel Fluid (BF)Durante un normale processo di fecondazione in vitro, una buona pratica per vetrificare gli embrioni aumenta le possibilità di una gravidanza sana. Durante il processo di vetrificazione un’esplosione sviluppata viene disidratata e la sua cavità blastocoel collassa per il processo di congelamento. Ci sono molti metodi che sono stati utilizzati per facilitare il collasso tra cui impulso laser, micropipetting ripetuto, puntura microneedle o microsuzione Normalmente questo fluido sarebbe poi essere scartato, tuttavia con test genetici preimpianto di BL, questo fluido viene salvato e quindi testato per il DNA. Si pensa che questo DNA provenga da cellule che hanno attraversato l’apoptosi trovata nell’embrione in via di sviluppo

Test genetici preimpianto utilizzando Blastocisti Culture Conditioned Medium (BCCM)Un altro metodo per i test genetici preimpianto meno invasivi comporta il test dei terreni di coltura in cui l’embrione si è sviluppato. È stato notato che l’embrione rilascia frammenti di DNA dalle cellule che sono morte entro il periodo di incubazione. Con questa conoscenza, gli scienziati hanno ragionato che potrebbero isolare questo DNA e usarlo per il test genetico preimpianto

I benefici e le conseguenze del test genetico preimpianto meno invasivomentre ci sono prove contrastanti sul fatto che i metodi più tradizionali del test genetico preimpianto siano dannosi per l’embrione esistono metodi più recenti per metodi di test meno invasivi e altrettanto efficaci. A tal fine ci siamo rivolti ai test genetici preimpianto utilizzando fluido blastocoel e mezzi embrionali esauriti. Un problema di queste alternative è la quantità minima di DNA con cui lavorare. Un’altra domanda molto importante è se questa tecnologia sia accurata o meno. Entrambe queste preoccupazioni sono state recentemente affrontate da Kuznyetsov. Kuznyetsov ha deciso di utilizzare entrambi i metodi combinando la quantità di DNA recuperato da entrambe le tecniche. Poi una volta che il DNA è stato isolato è stato utilizzato per il test genetico preimpianto. I risultati hanno mostrato che quando entrambi i metodi blastocisti fluido e embrione speso media sono stati utilizzati in combinazione hanno mostrato un tasso di cordance per l’intera copia cromosomica di 87.5% rispetto al trophectoderm, 96,4% rispetto all’intera Blastocisti (gold standard). Inoltre, dopo l’amplificazione con questo nuovo metodo, sono stati in grado di produrre 25,0-54,0 ng/ul di DNA per campione. Con metodi tradizionali come trophectoderm hanno raccolto da 10 a 44 ng/ul

Tecniche di analisi genetichedit

L’ibridazione fluorescente in situ (FISH) e la reazione a catena della polimerasi (PCR) sono le due tecnologie di prima generazione comunemente utilizzate nella PGD. La PCR viene generalmente utilizzata per diagnosticare disturbi monogenici e il PESCE viene utilizzato per la rilevazione di anomalie cromosomiche (ad esempio, screening aneuploidici o traslocazioni cromosomiche). Negli ultimi anni, vari progressi nei test PGD hanno permesso un miglioramento della completezza e dell’accuratezza dei risultati disponibili a seconda della tecnologia utilizzata. Recentemente è stato sviluppato un metodo che consente di fissare piastre metafase da singoli blastomeri. Questa tecnica in combinazione con il PESCE, m-FISH può produrre risultati più affidabili, poiché l’analisi viene eseguita su piastre metafase intere

Oltre al PESCE e alla PCR, il sequenziamento del genoma a singola cellula viene testato come metodo di diagnosi genetica preimpianto. Questo caratterizza la sequenza completa del DNA del genoma dell’embrione.

FISHEdit

Il PESCE è il metodo più comunemente applicato per determinare la costituzione cromosomica di un embrione. A differenza del cariotipo, può essere utilizzato su cromosomi interfase, in modo che possa essere utilizzato su campioni PBs, blastomeri e TE. Le cellule sono fissate su vetrini da microscopio e ibridate con sonde di DNA. Ciascuna di queste sonde sono specifiche per una parte di un cromosoma e sono etichettate con un fluorocromo.

Dual FISH è stata considerata una tecnica efficace per la determinazione del sesso degli embrioni umani preimpianto e la capacità aggiuntiva di rilevare il numero anomalo di copie cromosomiche, che non è possibile tramite la reazione a catena della polimerasi (PCR).

Attualmente, un ampio pannello di sonde è disponibile per diversi segmenti di tutti i cromosomi, ma il numero limitato di diversi fluorocromi limita il numero di segnali che possono essere analizzati simultaneamente.

Il tipo e il numero di sonde utilizzate su un campione dipendono dall’indicazione. Per la determinazione del sesso (utilizzata ad esempio quando non è disponibile un protocollo PCR per un dato disturbo legato all’X), vengono applicate sonde per i cromosomi X e Y insieme a sonde per uno o più autosomi come controllo interno del PESCE. Più sonde possono essere aggiunte per verificare la presenza di aneuploidie, in particolare quelle che potrebbero dare origine a una gravidanza vitale (come una trisomia 21). L’uso di sonde per cromosomi X, Y, 13, 14, 15, 16, 18, 21 e 22 ha il potenziale di rilevare il 70% delle aneuploidie trovate negli aborti spontanei.

Per poter analizzare più cromosomi sullo stesso campione, è possibile effettuare fino a tre cicli consecutivi di PESCI. Nel caso di riarrangiamenti cromosomici, devono essere scelte combinazioni specifiche di sonde che fiancheggiano la regione di interesse. Si ritiene che la tecnica del PESCE abbia un tasso di errore compreso tra il 5 e il 10%.

Il problema principale dell’uso del PESCE per studiare la costituzione cromosomica degli embrioni è l’elevato tasso di mosaicismo osservato nella fase preimpianto umana. Una meta-analisi di oltre 800 embrioni ha portato al risultato che circa il 75% degli embrioni preimpianto sono mosaico, di cui circa il 60% sono mosaico diploide–aneuploide e circa il 15% mosaico aneuploide. Li e colleghi hanno scoperto che il 40% degli embrioni diagnosticati come aneuploide al giorno 3 risultava avere una massa cellulare interna euploide al giorno 6. Staessen e collaboratori hanno scoperto che il 17,5% degli embrioni diagnosticati come anormali durante la PGS e sottoposti a rianalisi post-PGD, conteneva anche cellule normali e l ‘ 8,4% era trovato grossolanamente normale. Di conseguenza, è stato messo in discussione se una o due cellule studiate da un embrione siano effettivamente rappresentative dell’embrione completo e se gli embrioni vitali non vengano scartati a causa delle limitazioni della tecnica.

PCREdit

Kary Mullis concepì la PCR nel 1985 come riproduzione semplificata in vitro del processo in vivo di replicazione del DNA. Sfruttando le proprietà chimiche del DNA e la disponibilità di DNA polimerasi termostabili, la PCR consente l’arricchimento di un campione di DNA per una determinata sequenza. La PCR offre la possibilità di ottenere una grande quantità di copie di un particolare tratto del genoma, rendendo possibili ulteriori analisi. È una tecnologia altamente sensibile e specifica, che lo rende adatto a tutti i tipi di diagnosi genetica, inclusa la PGD. Attualmente, esistono molte varianti diverse sulla PCR stessa, così come sui diversi metodi per l’analisi posteriore dei prodotti PCR.

Quando si utilizza la PCR nella PGD, ci si trova di fronte a un problema inesistente nell’analisi genetica di routine: le quantità minime di DNA genomico disponibile. Poiché la PGD viene eseguita su singole celle, la PCR deve essere adattata e spinta ai suoi limiti fisici e utilizzare la quantità minima di modello possibile: che è un filamento. Ciò implica un lungo processo di messa a punto delle condizioni PCR e una suscettibilità a tutti i problemi della PCR convenzionale, ma diversi gradi intensificati. L’elevato numero di cicli di PCR necessari e la quantità limitata di modelli rendono la PCR a cella singola molto sensibile alla contaminazione. Un altro problema specifico della PCR a cella singola è il fenomeno dell’allele drop out (ADO). Consiste nella non amplificazione casuale di uno degli alleli presenti in un campione eterozigote. ADO compromette seriamente l’affidabilità della PGD in quanto un embrione eterozigote potrebbe essere diagnosticato come affetto o inalterato a seconda di quale allele non riuscirebbe ad amplificare. Ciò è particolarmente preoccupante nella PGD per i disturbi autosomici dominanti, dove l’ADO dell’allele affetto potrebbe portare al trasferimento di un embrione affetto.

Sono stati sviluppati diversi test basati su PCR per varie malattie come i geni triplet repeat associati alla distrofia miotonica e all’X fragile in singole cellule somatiche umane, gameti ed embrioni.

NGSEdit

Dal 2014, il sequenziamento di nuova generazione (NGS) viene eseguito nel PGT. NGS, noto anche come massive parallel sequencing, è un gruppo di tecniche in grado di sequenziare grandi quantità di DNA ad un costo e un tempo ragionevoli. Può darci una prospettiva generale del genoma completo dell’embrione, incluso quello mitocondriale. Queste tecniche si basano sul sequenziamento di brevi letture circa 400 basi ciascuna e sovrappongono queste letture con un potente software di allineamento.

Allo stesso modo, NGS ci consente anche di rilevare aneuploidie nei 24 cromosomi e difetti monogenici quando c’è un’indicazione dai genitori portatori. Il vantaggio principale è che NGS può combinare il rilevamento di aneuploidie e malattie monogeniche con una singola biopsia e ha ridotto i costi accessibili, rendendolo più accessibile.

Due esempi di NGS sono il pyrosequencing e il terminatore di tintura reversibile.

Stabilire una diagnosimodifica

Stabilire una diagnosi in PGD non è sempre semplice. I criteri utilizzati per la scelta degli embrioni da sostituire dopo i risultati del FISH o della PCR non sono uguali in tutti i centri.Nel caso dei PESCI, in alcuni centri vengono sostituiti solo gli embrioni che risultano cromosomicamente normali (cioè che mostrano due segnali per i gonosomi e gli autosomi analizzati) dopo l’analisi di uno o due blastomeri, e quando vengono analizzati due blastomeri, i risultati dovrebbero essere concordanti. Altri centri sostengono che gli embrioni diagnosticati come monosomici potrebbero essere trasferiti, perché la falsa monosomia (cioè la perdita di un segnale di PESCE in una normale cellula diploide) è la diagnosi errata più frequente. In questi casi, non vi è alcun rischio per una gravidanza aneuploide e gli embrioni diploidi normali non vengono persi per il trasferimento a causa di un errore di PESCE. Inoltre, è stato dimostrato che gli embrioni diagnosticati come monosomici al giorno 3 (ad eccezione dei cromosomi X e 21), non si sviluppano mai in blastocisti, il che è correlato al fatto che queste monosomie non vengono mai osservate nelle gravidanze in corso.

La diagnosi e la diagnosi errata nella PGD utilizzando la PCR sono state matematicamente modellate nel lavoro di Navidi e Arnheim e di Lewis e collaboratori. La conclusione più importante di queste pubblicazioni è che per una diagnosi efficiente e accurata di un embrione sono necessari due genotipi. Questo può essere basato su un marcatore collegato e genotipi di malattia da una singola cellula o su genotipi di marker/malattia di due cellule. Un aspetto interessante esplorato in questi documenti è lo studio dettagliato di tutte le possibili combinazioni di alleli che possono apparire nei risultati della PCR per un particolare embrione. Gli autori indicano che alcuni dei genotipi che possono essere ottenuti durante la diagnosi potrebbero non essere concordanti con il modello atteso di genotipi marker collegati, ma stanno ancora fornendo sufficiente fiducia sul genotipo non influenzato dell’embrione. Sebbene questi modelli siano rassicuranti, si basano su un modello teorico e generalmente la diagnosi viene stabilita su una base più conservativa, al fine di evitare la possibilità di diagnosi errate. Quando alleli inaspettati compaiono durante l’analisi di una cellula, a seconda del genotipo osservato, si ritiene che sia stata analizzata una cellula anomala o che si sia verificata una contaminazione e che non sia possibile stabilire una diagnosi. Un caso in cui l’anomalia della cellula analizzata può essere chiaramente identificata è quando, utilizzando una PCR multiplex per marcatori collegati, nel campione si trovano solo gli alleli di uno dei genitori. In questo caso, la cellula può essere considerata come portatrice di una monosomia per il cromosoma su cui si trovano i marcatori o, eventualmente, come aploide. L’aspetto di un singolo allele che indica un genotipo affetto è considerato sufficiente per diagnosticare l’embrione come affetto e gli embrioni a cui è stato diagnosticato un genotipo completo non affetto sono preferiti per la sostituzione. Sebbene questa politica possa portare a un numero inferiore di embrioni non affetti adatti al trasferimento, è considerata preferibile alla possibilità di una diagnosi errata.

Aplotipizzazione genetica preimpianto

L’aplotipizzazione genetica preimpianto (PGH) è una tecnica PGD in cui viene identificato un aplotipo di marcatori genetici che hanno associazioni statistiche a una malattia bersaglio piuttosto che la mutazione che causa la malattia.

Una volta stabilito un pannello di marcatori genetici associati per una particolare malattia, può essere utilizzato per tutti i portatori di tale malattia. Al contrario, poiché anche una malattia monogenica può essere causata da molte mutazioni diverse all’interno del gene interessato, i metodi convenzionali di PGD basati sulla ricerca di una mutazione specifica richiederebbero test specifici per la mutazione. Pertanto, il PGH allarga la disponibilità di PGD ai casi in cui non sono disponibili test specifici per la mutazione.

PGH ha anche un vantaggio rispetto al PESCE in quanto il PESCE di solito non è in grado di effettuare la differenziazione tra gli embrioni che possiedono la forma bilanciata di una traslocazione cromosomica e quelli che trasportano i cromosomi normali omologhi. Questa incapacità può essere seriamente dannosa per la diagnosi fatta. PGH può fare la distinzione che il pesce spesso non può. PGH fa questo utilizzando marcatori polimorfici che sono più adatti a riconoscere le traslocazioni. Questi marcatori polimorfici sono in grado di distinguere tra embrioni che trasportavano traslocazioni normali, bilanciate e sbilanciate. FISH richiede anche più fissazione cellulare per l’analisi, mentre PGH richiede solo il trasferimento di cellule in tubi di reazione a catena della polimerasi. Il trasferimento delle celle è un metodo più semplice e lascia meno spazio all’errore di analisi.

Trasferimento di embrioni e crioconservazione di embrioni in eccedenzamodifica

Il trasferimento di embrioni viene solitamente eseguito il terzo o il quinto giorno post-fecondazione, i tempi dipendono dalle tecniche utilizzate per la PGD e dalle procedure standard del centro IVF in cui viene eseguito.

Con l’introduzione in Europa della politica di trasferimento di un solo embrione, che mira a ridurre l’incidenza di gravidanze multiple dopo ART, di solito un embrione o una blastocisti precoce viene sostituito nell’utero. hCG sierico è determinato al giorno 12. Se viene stabilita una gravidanza, viene eseguito un esame ecografico a 7 settimane per confermare la presenza di un battito cardiaco fetale. Le coppie sono generalmente invitati a sottoporsi PND a causa del, anche se basso, rischio di diagnosi errata.

Non è insolito che dopo la PGD, ci siano più embrioni adatti per il trasferimento alla donna del necessario. Per le coppie sottoposte a PGD, quegli embrioni sono molto preziosi, poiché il ciclo corrente della coppia potrebbe non portare a una gravidanza in corso. La crioconservazione dell’embrione e il successivo scongelamento e sostituzione possono dare loro una seconda possibilità alla gravidanza senza dover rifare le procedure ART e PGD ingombranti e costose.