Inleiding

de Oogheelkundige postherpetic neuralgie (PHN) is een invaliderende en uitgebreid onderzocht neuropathische pijn aandoening die wordt veroorzaakt door het herpes zoster en aanhoudende of terugkerende voor ten minste 3 maanden in gebieden die geleverd wordt door de oogheelkundige afdeling van de trigeminale zenuw (IHS Classificatie, 2013).1

Studies ter beoordeling van cutane innervatie in huidbiopsie-specimens hebben nieuw inzicht verschaft in de mechanismen die ten grondslag liggen aan neuropathische pijn in verschillende aandoeningen (Sommer and Lauria, 2007). De biopsie van de huid is een minimaal invasief diagnostisch hulpmiddel dat wordt gebruikt om zenuwvezel in de menselijke epidermis en dermis te beoordelen. Epidermale innervatie bestaat voornamelijk uit unmyelinated C-fiber terminals, met relatief weinig kleine myelinated Aδ-vezels die hun myeline schede verliezen en de epidermis bereiken als unmyelinated vrije zenuwuiteinden. Omgekeerd, dermale innervatie bestaat voornamelijk uit grote myelinated Aß-vezels die takken te sturen naar dermale bloedlichaampjes en haarfollikels (Nolano et al., 2003, 2013).

De meeste morfometrische studies gebruikten bright-field immunohistochemie met proteïne genproduct (PGP) 9.5 immunostaining en beoordeelden alleen epidermale innervatie. Een benadering gebaseerd op immunofluorescentie en confocale microscopie met behulp van dubbele en drievoudige immunostaining met een uitgebreid panel van antilichamen waaronder de pan-neuronale marker PGP 9.5, de keldermembraan marker, collageen IV (ColIV), en antilichamen voor verschillende myelinated en unmyelinated zenuwvezel populaties, heeft bewezen om verschillende informatie over sensorische en autonome zenuwvezels, en eventueel beoordelen huid innervatie nauwkeuriger (Doppler et al., 2012; Nolano et al., 2013).

hoewel eerdere huidbiopsie-onderzoeken een ernstig verlies van de epidermale zenuwvezel (ENF) hebben aangetoond in de aangetaste thoracale dermatomen van patiënten met PHN (Oaklander, 2001; Petersen et al., 2010), hebben ze niet direct onderzocht oftalmische PHN, noch hebben ze onderscheiden epidermale unmyelinated en dermale myelinated vezels, of nauwkeurig detail autonome zenuwvezel betrokkenheid. Het hebben van deze informatie kan de pathofysiologische mechanismen die ten grondslag liggen aan PHN preciezer definiëren, waardoor mogelijk de manier waarop we deze uitzonderlijk resistente neuropathische pijnaandoening diagnosticeren en genezen wordt verbeterd.voortzetting van onze onderzoeksinteresse naar de mechanismen die ten grondslag liggen aan neuropathische pijn bij perifere zenuwaandoeningen (Truini et al., 2014) met inbegrip van PHN (Truini et al., 2008), in deze klinische en morfometrische studie, wilden we onderzoeken hoe oftalmische PHN myelinated en unmyelinated sensorische en autonome huidzenuwvezels beïnvloedt. Om dit te doen namen we 2-mm supraorbitale punch huidbiopten van de aangetaste kant en onaangetast spiegel kant in tien patiënten met oogheelkundige PHN. Wij behandelden de huidspecimens met indirecte immunofluorescentie, onderzochten de specimens door confocale microscopie, onderscheiden epidermale unmyelinated en dermale myelinated innervation, en beschreven autonome zenuwvezel betrokkenheid.

materialen en methoden

we namen 10 patiënten (3 F, 7 M; 74,5 ± 4,4 jaar) met oftalmische PHN in de afdeling Neurologie, Sapienza Universiteit, Rome in. Oftalmische PHN werd gediagnosticeerd volgens de diagnostische criteria van de International Headache Society: pijn die minstens 3 maanden aanhoudt of terugkeert in het gebied dat wordt geleverd door de oogafdeling van de nervus trigeminus, en veroorzaakt wordt door herpes zoster. Uitsluitingscriteria waren cognitieve stoornissen en andere ziekten van het centrale en perifere zenuwstelsel. Geen enkele patiënt werd behandeld met actuele pijnstillers (d.w.z. lidocaïne en capsaïcine).

De Institutional Review Board van het departement Neurologie, Policlinico Umberto I, Rome, keurde het onderzoek goed en de patiënten gaven hun geïnformeerde toestemming.

klinische en neurofysiologische beoordeling

Alle deelnemers ondergingen een algemeen onderzoek en een neurologisch onderzoek, met volledige sensorische testen, waaronder negatieve (tactiele, pinprick en thermische hypo-esthesie) en positieve symptomen (aanhoudende spontane pijn, paroxysmale pijn) en tekenen (mechanische dynamische allodynie en pinprick hyperalgesie). De aanwezigheid en de ernst van negatieve symptomen werden beoordeeld door de aangetaste kant te vergelijken met het spiegelbeeld aan de gezonde kant. De ernst van de verschillende pijntypen (d.w.z. aanhoudende spontane pijn, paroxysmale pijn, mechanische dynamische allodynie, pinprick hyperalgesie) werd beoordeeld op een 0-10 numerieke beoordelingsschaal (NRS; 0 = geen gevoel, 10 = slechtst mogelijke pijn).

bij alle patiënten registreerden we de Aß-myelinated fiber-mediated blink reflex, met methoden die voldoen aan de aanbevelingen van de International Federation of Clinical Neurophysiology guidelines (Deuschl and Eisen, 1999). Om de aδ-en c-vezelfunctie te onderzoeken registreerden we laser-opgeroepen potentialen, volgens een eerder gerapporteerde techniek (Truini et al., 2008).

huidbiopsie

twee-mm punch huidbiopten werden direct boven de wenkbrauw genomen van de aangetaste en onaangetaste spiegelzijde. De wond genas binnen enkele dagen zonder zichtbaar litteken (figuur 1). Huidmonsters werden verwerkt met immunohistochemische technieken, zoals eerder beschreven (Nolano et al., 2013). De monsters werden ‘ s nachts gefixeerd in de Zamboni-oplossing, cryoprotected in 20% sucrose in fosfaatgebufferde zoutoplossing en gesneden in 50 µm dikke secties op een vriesmicrotoom (Leica 2000R, Duitsland). Vrij zwevende secties werden verwerkt voor indirecte immunofluorescentie met behulp van een antilichaampaneel om sensorische, autonome huidinnervatie-en vasculaire structuren te bevlekken, waaronder pgp9.5, calcitonine-gengerelateerde peptide (CGRP), substance P (SubP) en vasoactive intestinal peptide (VIP) antilichamen (Tabel 1). De digitale beelden werden verworven gebruikend niet-Laser confocal microscopie (CARV confocal systeem; ATTO Biosciences, USA en Apotome confocal system; Zeiss, Duitsland).

figuur 1. Twee mm supraorbitale punch huid biopsie. (A) Foto van een patiënt met postherpetische neuralgie (PHN) die de 2 mm huidwonde onmiddellijk na de punch toont. (B) na 1 week is het litteken nauwelijks zichtbaar.

Tabel 1. Afkorting, bron en verdunning van immunohistochemische markers.

ENF-dichtheid werd bepaald in de 2 mm skin punch biopsie monsters door Neurolucida software (MicroBrightField Bioscience, USA) toe te passen op vier 20× Z-serie confocale beelden (2 µm × 16 stappen), verkregen uit vier willekeurig geselecteerde secties voor elk monster. Dermale myelinated zenuwvezels werden gekwantificeerd met behulp van anti-myeline basische eiwitantilichamen in het gehele dermale oppervlak inclusief 1 mm Diepte van het keldermembraan in drie willekeurige secties voor elk monster, na eerder gepubliceerde procedure (Nolano et al., 2013). Een gekalibreerd raster (2 × 1 mm) met een reeks van zeven evenwijdige parallelle lijnen werd toegepast op een digitaal niet-confocaal 5× origineel vergrotingsbeeld van myeline basic proteïne-bevlekte secties. Alle Onderscheppingen tussen gemelineerde vezels en de rasterlijnen werden geteld. De dichtheid van de huidge myelineerde zenuwvezels werd berekend als het aantal vezels dat het raster per huidgebied onderschept (onderschept per mm2). Een enkele operator heeft blindelings de zenuwvezel van de huid gekwantificeerd in elk monster. VIP-ir sudomotorische zenuwlengte dichtheid (nm / mm3) werd berekend met behulp van de zenuw tracing module Autoneuron, een onderdeel van Neurolucida software , zoals eerder beschreven (Provitera et al., 2014). Om te beoordelen peptidergic vezels (SubP, CGRP en VIP-ir) in de subepidermal neurale plexus, op minder dan 100 µm van de basaalmembraan, een semikwantitatieve scoren werd toegepast (0 = afwezigheid van vezels, 1 = zelden vezel segmenten, korter dan 10 µm, 2 = weinig vezels, vullen grotendeels denervated dermis, 3 = normaal, verschillende vezels die het grootste gedeelte van de subepidermal neurale plexus).

huidbiopsie bevindingen bij de 10 patiënten werden vergeleken met een overeenkomende steekproef van 10 gezonde proefpersonen (epidermale zenuwvezel dichtheid: 18,9 ± 3,7/mm, dermale myelinated vezel dichtheid: 6,7 ± 1,4/mm; Nolano et al., 2013).

statistische analyse

alle gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD. De normale verdeling van de epidermale en dermale myelinated vezel dichtheid werd geëvalueerd met behulp van D ‘ Agostino en Pearson omnibus normaliteit test. De Wilcoxon matched-pair test werd gebruikt voor het vergelijken van neurofysiologische en huid biopsie variabelen tussen onaangetast en aangetaste zijden. De Mann Whitney-test werd gebruikt voor het vergelijken van huidbiopsievariabelen tussen PHN-patiënten en normale controles. Correlaties tussen de ENF-dichtheid en de PHN-duur werden berekend met de Pearson ‘ s r-correlatiecoëfficiënt. P-waarden kleiner dan of gelijk aan 0,05 werden geacht statistische significantie aan te geven.

resultaten

bij klinisch onderzoek klaagden alle tien patiënten over sensorische defecten waarbij alle sensorische modaliteiten betrokken waren en meldden aanhoudende spontane pijn (NRS: 4,3 ± 1,4); vijf patiënten klaagden ook over mechanische dynamische allodynie (NRS: 3,5 ± 0,7).

neurofysiologische tests toonden ernstige afwijkingen waarbij alle geteste variabelen betrokken waren. Bij alle patiënten Aß-fiber-gemedieerde knipperreflex, het stimuleren van de aangetaste kant, opgewekt abnormale (vertraagd of afwezig) reacties. Laser-waarnemingsdrempels waren hoger en aδ-en C-laser opgeroepen potentiële amplituden lager na het stimuleren van de aangetaste zijde dan na het stimuleren van de onaangetaste zijde (p < 0,05, Wilcoxon-test). Bij 2 van de 10 patiënten waren laser-geïnduceerde potentialen gerelateerd aan C-vezelstimulatie ook afwezig bij de niet-aangetaste zijde (Tabel 2).

Tabel 2. Afkorting, bron en verdunning van immunohistochemische markers.

confocale immunofluorescentieanalyse toonde aan dat huidinnervatie in de supraorbitale punch huidbiopten van patiënten met PHN opvallend verschilde tussen de niet-aangetaste (figuren 2A,C,E) en de aangetaste zijden (figuren 2B,D,F). Terwijl de steekproeven van de huidbiopsie van de onaangetaste kant een vrij dichte en regelmatige innervatie vertoonden, verscheen de epidermis in de aangetaste kant slecht en ongelijk innervated met clusters en lange traktaten zonder zenuwvezels (figuren 2A–D). Semiquantatieve analyse toonde aan dat de subepidermale plexus slecht en gestoord leek en, vergeleken met de onaangetaste zijde, minder (p < 0,001) CGRP (1,4 ± 0,8 vs.2,5 ± 0,5), SubP (1,1 ± 0,6 vs. 2,3 ± 0,7), en VIP (1,0 ± 0,7 vs. 2,2 ± 0,8) immunoreactieve (IR) zenuwvezels bevatte. Haarfollikels leken slecht geïnnerveerd met weinig niet-gemyelineerde en gemyelineerde vezels (figuren 2F,E). Epidermaal en dermaal gemyelineerd vezelverlies varieerde van matig tot ernstig en 3 van de 10 patiënten hadden volledige huiddenervatie. De weinige overlevende epidermale axonen waren geclusterd tussen gebieden van de denerfde epidermis. Myelinated vezels vertoonden verschillende morfologische afwijkingen, zoals fragmentatie, frequente voorkomen van een langere knooplengte dan normaal (7 µm of langer; Nolano et al., 2003), en caliber onregelmatigheden met uitbreiding en krimp (verandering in diameter meer dan 100%) binnen dezelfde internode. Deze kenmerken werden zelden waargenomen in de onaangetaste zijde. In tegenstelling tot sensorische innervatie bleken beide componenten, adrenerge en cholinerge, van autonome innervatie aan de huid bijlagen relatief behouden (Figuur 3). De onaangetaste en aangetaste zijden vertoonden talrijke cholinerge (VIP-ir) sudomotorische (figuren 3C,D) en adrenerge (DbH-ir) pilomotorische (figuren 3E,F) vezels. Cholinerge sudomotorische zenuwvezeldichtheid verschilde niet tussen de aangetaste (1,9 ± 0.7 nm / mm3) en onaangetaste zijde (2,0 ± 0,5 nm/mm3).

Figuur 2. Huid innervatie. Confocale beelden die huidinnervatie in de onaangetaste (A,C,E) en aangetaste kant (B,D,F) in een representatieve patiënt met PHN tonen. Ernstige epidermale en dermale zenuwvezel verlies is zichtbaar in de huid biopsie specimens van de aangetaste kant (B vs.A). De epidermis in de aangetaste kant toont een lange tractaat verstoken van zenuwvezels en zenuwvezel clusters (d VS. C). Opvallend unmyelinated en myelinated verlies van zenuwvezels rond haarfollikels (F vs. E). Staven: 100 µm in (A, B,E,F); 25 µm in (C, D).

Figuur 3. Autonome huid innervatie. Confocale beelden die autonome innervatie aan dermale bijlagen in de getroffen (A,C,E) en onaangetaste kant (B,D,F) tonen. De hogere dermis rond haarfollikelen in de beà nvloede kant bevat minder vasoactive intestinale peptide-immunoreactive (VIP-IR) vezels dan het zelfde huidgebied in de onaangetaste kant (A versus B) terwijl VIP-ir sudomotor en DBH-ir pilomotor innervation goed is begiftigd (D en F versus C en E). Bar: 100 µm in (A, B); 50 µm in (C,D), 25 µm in (E,F).

kwantitatieve analyse (gebaseerd op analyse van pgp9.5 en myeline basic protein (MBP) immunoreactiviteit) van de huidbiopsiemonsters toonde een significant lagere epidermale en dermale myelinated vezeldichtheid aan in de aangetaste zijde dan in de niet-aangetaste zijde (3,1 ± 3,3 en 2,1 ± 2,8 vs.17,2 ± 8,9 en 6,6 ± 5,0/mm2; p <0,01, tabel 2). De verhouding tussen epidermale en dermale myelinated zenuwvezels was significant lager bij de aangetaste dan bij de niet-aangetaste zijde (1,1 ± 1,0 vs.4.3 ± 5,3; p < 0,01).

hoewel de ENF-dichtheid toenam met de PHN-duur, kon deze correlatie geen statistische significantie bereiken (r: 0,5574, p = 0,09; Figuur 4).

Figuur 4. Correlatie tussen epidermale zenuwvezel (ENF) dichtheid en PHN duur. Hoewel de ENF-dichtheid toenam met de PHN-duur, miste deze correlatie de statistische significantie (epidermale zenuwvezel: r: 0,5574, p = 0,09).

De gemiddelde waarden voor de unmyelinated en gemyeliniseerde zenuw-vezel dichtheden in de niet-aangedane kant niet afwijken van de controles (epidermale nerve fiber density: 17.2 ± 8.9/mm vs. 18.9 ± 3.7/mm; dermaal gemyeliniseerde vezel dichtheid: 6.6 ± 5.0/mm vs. 6.7 ± 1.4/mm; p > 0.3, door Mann-Whitney-test). Echter, bij de twee patiënten met abnormale C-fiber-gemedieerde laser opgeroepen potentialen, huidbiopsie toonde een epidermale en een dermale myelinated zenuwvezel verlies ook in de onaangetaste kant (0,8 en 3,6/mm in de onaangetaste en 0,0 en 0.3 / mm in de aangetaste zijde).

discussie

onze klinische en morfometrische studie, die de innervatie van de huid in supraorbitale punch huidbiopten met indirecte immunofluorescentie en confocale microscopie evalueert, geeft nieuwe informatie die specificeert dat, hoewel oftalmische PHN zowel epidermale niet-gemyelineerde als gemyelineerde zenuwvezels beïnvloedt, het voornamelijk niet-gemyelineerde zenuwvezels beschadigt en autonome innervatie van de huid reserveert.

klinisch onderzoek toonde aan dat alle patiënten tactiele, speldenprik en warme hypo-esthesie hadden. Dienovereenkomstig waren alle drie neurofysiologische variabelen die we registreerden (de Aß-fiber gemedieerde blink reflex, Aδ – en C-laser opgeroepen potentialen) abnormaal. Terwijl klinische beoordeling en neurofysiologische testen zowel myelinated als unmyelinated vezel schade toonden, gaf de beoordeling van de huidbiopsie aan dat PHN-gerelateerde schade aan huidinnervatie verschilde in myelinated en unmyelinated vezels. Meer specifiek wijst de lagere niet-gemyelineerde/myelineerde verhouding in de aangetaste zijde dan in de onaangetaste spiegelzijde op een overheersend verlies van de epidermale niet-gemyelineerde zenuwvezels. Deze nieuwe morfometrische bevinding komt overeen met eerdere studies die alleen epidermale innervatie onderzochten en, een variabel unmyelinated vezelverlies lieten zien (Oaklander, 2001; Petersen et al., 2010; Reda et al., 2013). De overheersende niet-gemyelineerde betrokkenheid van zenuwvezels die we beschrijven bij patiënten met PHN past in hun typische aanhoudende pijn. Dit type pijn weerspiegelt waarschijnlijk secundaire neuroplastische veranderingen en spontane hyperactiviteit in de anatomisch denervated tweede orde nociceptieve neuronen (Truini et al., 2013). Door de kleine studiesteekproef konden we mogelijke correlaties tussen pijn en klinische, neurofysiologische en morfologische afwijkingen niet betrouwbaar onderzoeken. Deze vraag verdient onderzoek in een verdere studie waarbij meer patiënten worden ingeschreven.

in deze huidbiopsie-studie, waarbij gebruik wordt gemaakt van indirecte immunofluorescentie en confocale microscopie, bieden we voorheen niet-gerapporteerde gedetailleerde informatie over Huid autonome innervatie bij patiënten met oftalmische PHN. Terwijl autonome innervatie aan zweetklieren en aan erector pilorum spieren werd gespaard, zagen we een slechte vertegenwoordiging van VIP-ir vezels in de bovenste dermis, rond vaten en haarfollikels, waar er ook een slechte vertegenwoordiging van CGRP en SubP was. Sommige van deze vezels moduleren haarfollikelfunctie en gezichts vasomotorische controle, en kunnen afkomstig zijn van de sensorische trigeminale zenuw (Izumi, 1995, 1999). Deze oorsprong kan hun betrokkenheid bij PHN verklaren, terwijl de niet-betrokken sudomotorische en pilomotorische VIP-IR zenuwvezels waarschijnlijk afkomstig zijn van de superieure cervicale sympathische ganglia en van craniale parasympathische zenuwen die PHN intact laat. Gezien het feit dat veel studies suggereren dat het autonome zenuwstelsel zou kunnen deelnemen aan de ontwikkeling van pijn (Fields et al., 1998), de autonome zenuwvezel sparing die we hier beschrijven zou de voorgestelde indirecte koppeling tussen intacte sympathische postganglionische en beschadigde primaire afferente unmyelinated neuronen (Drummond et al., 2014).

bij onze patiënten met oftalmische PHN-huidbiopsie bleek dat de weinige overlevende axonen in de aangetaste zijde waren geclusterd tussen gebieden met denerfde epidermis en dat de ENF-dichtheid neigde toe te nemen met de duur van de ziekte. Deze observatie leidt ons tot vermoeden dat de huid wat zenuw remodellering in de tijd zou kunnen ondergaan. Deze veranderingen zouden kunnen plaatsvinden wanneer de overlevende axonen collateralen ontkiemen in een poging om het ontkendegebied te bezetten. Dit anatomische remodelleren kan ook tot enkele functionele verbetering leiden. Toegegeven, onze hypothese suggereert een gedeeltelijke reïnervatie in de tijd bij patiënten met oogheelkundige PHN pleit tegen pivotal studies gericht op de natuurlijke geschiedenis van thoracale PHN (Petersen et al., 2010; Reda et al., 2013). Deze studies met behulp van functionele maatregelen en huidbiopsie concluderen dat zelfs bij 7,7 jaar, er slechts een bescheiden herstel van de sensorische functie en geen anatomische herstel ondanks pijn resolutie in de meerderheid van de patiënten. In het bijzonder toonde de studie van Reda en collega ‘ s aan dat hoewel pijn en de meeste metingen van de zintuiglijke functie, zintuiglijke symptomen en capsaïcine respons een trend naar verbetering bleven gedurende een lange termijn follow-up, veel proefpersonen nog steeds zintuiglijke afwijkingen ondervonden. Hoewel we niet kunnen uitsluiten dat de betrouwbaarheid van onze bevindingen kan worden beïnvloed door de kleine steekproef van patiënten, blijft de vraag of het trigeminus-systeem, een eigenaardig gebied, meer vatbaar is voor huidreïnervatie dan andere lichaamsgebieden een interessante vraag voor toekomstig onderzoek.

De gemiddelde dichtheid van de epidermale en dermale myelinated vezel en hun verhouding in de onaangetaste spiegelzijde verschilde niet van de controlegroep. Nochtans in twee van de tien patiënten die wij bestudeerden, waren C-vezel-verwante laser geëvoceerde potentialen afwezig na het bevorderen van de onaangetaste kant en beide patiënten hadden mild epidermaal vezelverlies, hoewel minder streng in de onaangetaste dan in de aangetaste kant. Deze bevinding is in lijn met eerdere klinische, neurofysiologische en huidbiopsiestudies die bilaterale schade aan zenuwvezels aantonen en ondersteunt de hypothese dat PHN af en toe milde, subklinische sensorische afferente pathway betrokkenheid bij de onaangetaste kant kan veroorzaken (haanpää et al., 1997; Oaklander et al., 1998; Truini et al., 2008).

onze huidbiopsie-studie toont aan dat oftalmische PHN differentieel de epidermale en dermale myelinated vezels aantast en de autonome innervatie van de huid spaart, levert nieuwe informatie op voor het begrijpen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan deze invaliderende aandoening.

Auteursbijdragen

belangenverstrengeling verklaring

De auteurs verklaren dat het onderzoek werd uitgevoerd in afwezigheid van commerciële of financiële relaties die als een potentieel belangenconflict kunnen worden opgevat.

voetnoten

1. ^ http://www.ihs-classification.org/_downloads/mixed/International-Headache-Classification-III-ICHD-III-2013-Beta.pdf