PGD jest formą diagnostyki genetycznej wykonywaną przed implantacją. Oznacza to, że oocyty pacjenta powinny być zapłodnione in vitro, a zarodki przechowywane w hodowli do czasu ustalenia diagnozy. Konieczne jest również wykonanie biopsji tych zarodków w celu uzyskania materiału, na którym można wykonać diagnozę. Sama diagnoza może być przeprowadzona przy użyciu kilku technik, w zależności od charakteru badanego stanu. Ogólnie, metody oparte na PCR są stosowane w przypadku zaburzeń monogennych i ryb dla nieprawidłowości chromosomalnych oraz do seksuowania tych przypadków, w których nie jest dostępny Protokół PCR dla choroby związanej z X. Techniki te muszą być dostosowane do wykonywania na blastomerach i muszą być dokładnie przetestowane na modelach jednokomórkowych przed zastosowaniem klinicznym. Wreszcie, po wymianie zarodka, nadwyżki nienaruszonych zarodków dobrej jakości można poddać krioprezerwacji, rozmrożeniu i przeniesieniu z powrotem w następnym cyklu.

uzyskiwanie embrionówedytuj

obecnie wszystkie embriony PGD są uzyskiwane za pomocą technologii wspomaganego rozrodu, chociaż w przeszłości próbowano stosować naturalne cykle i zapłodnienie in vivo, a następnie płukanie macicy i obecnie w dużej mierze zrezygnowano z nich. W celu uzyskania dużej grupy oocytów pacjenci poddawani są kontrolowanej stymulacji jajników (CoH). COH przeprowadza się w ramach protokołu agonistycznego z zastosowaniem analogów hormonu uwalniającego gonadotropinę (GnRH) do odczulania przysadki w połączeniu z ludzkimi gonadotropinami menopauzalnymi (hMG) lub rekombinowanym hormonem folikulotropowym (FSH) lub protokołu antagonistycznego z zastosowaniem rekombinowanego FSH w połączeniu z antagonistą GnRH zgodnie z kliniczną oceną profilu pacjenta (wiek, wskaźnik masy ciała (BMI), parametry endokrynologiczne). hCG podaje się, gdy podczas przezpochwowego badania ultrasonograficznego widoczne są co najmniej trzy pęcherzyki o średniej średnicy powyżej 17 mm. Przezpochwowe badanie ultrasonograficzne komórek jajowych zaplanowano na 36 godzin po podaniu hCG. Suplementacja w fazie lutealnej polega na codziennym podaniu dopochwowym 600 µg naturalnego mikronizowanego progesteronu.

oocyty są starannie denudowane z komórek cumulusa, ponieważ komórki te mogą być źródłem zanieczyszczenia podczas PGD, jeśli stosowana jest technologia oparta na PCR. W większości zgłoszonych cykli zamiast IVF stosuje się intracytoplasmic sperm injection (ICSI). Głównymi przyczynami są zapobieganie zanieczyszczeniu resztkami plemników przylegających do zona pellucida i unikanie nieoczekiwanego niepowodzenia zapłodnienia. Zabieg ICSI przeprowadza się na dojrzałych oocytach metafazy II, a zapłodnienie ocenia się po 16-18 godzinach. Rozwój zarodka jest dalej oceniany codziennie przed biopsją i do momentu przeniesienia do macicy kobiety. Na etapie rozszczepiania, ocena zarodka jest wykonywana codziennie na podstawie liczby, wielkości, kształtu komórki i szybkości fragmentacji blastomerów. W dniu 4 zarodki oceniano w zależności od stopnia ich zagęszczenia, a blastocysty oceniano w zależności od jakości throfektodermy i masy wewnętrznej komórek oraz stopnia ich ekspansji.

procedury Biopsyjneedytuj

ponieważ PGD można wykonać na komórkach z różnych stadiów rozwoju, procedury biopsji różnią się odpowiednio. Teoretycznie biopsję można wykonać na wszystkich etapach przedimplantacji, ale zasugerowano tylko trzy: na niezapłodnionych i zapłodnionych oocytach (dla ciał polarnych, PBs), na zarodkach w trzecim dniu rozszczepiania (dla blastomerów) i na blastocystach (dla komórek trofektodermy).

procedura biopsji zawsze obejmuje dwa etapy: otwarcie zona pellucida i usunięcie komórki(komórek). Istnieją różne podejścia do obu etapów, w tym mechaniczne, chemiczne i fizyczne (kwaśny roztwór tyrode ’ a) i technologii laserowej do naruszania zona pellucida, wytłaczania lub aspiracji do usuwania PBs i blastomerów i przepukliny komórek trophectoderm.

biopsja ciała Polarnegoedytuj

biopsja ciała polarnego to pobranie próbki ciała polarnego, które jest małą haploidalną komórką, która powstaje jednocześnie jako komórka jajowa podczas oogenezy, ale która zazwyczaj nie ma zdolności do zapłodnienia. W porównaniu do biopsji blastocysty, biopsja ciała polarnego może potencjalnie mieć niższe koszty, mniej szkodliwych skutków ubocznych i bardziej wrażliwe na wykrywanie nieprawidłowości. Główną zaletą stosowania ciał polarnych w PGD jest to, że nie są one niezbędne do pomyślnego zapłodnienia lub normalnego rozwoju embrionalnego, zapewniając w ten sposób brak szkodliwego wpływu na zarodek. Jedną z wad biopsji PB jest to, że dostarcza ona jedynie informacji o udziale matki w zarodku, dlatego można diagnozować przypadki dziedziczonych autosomalnie dominujących i związanych z X zaburzeń, które są przenoszone wyłącznie przez matkę, a autosomalnie recesywnych zaburzeń można diagnozować tylko częściowo. Inną Wadą jest zwiększone ryzyko błędu diagnostycznego, na przykład z powodu degradacji materiału genetycznego lub zdarzeń rekombinacji, które prowadzą do heterozygotycznych pierwszych ciał polarnych.

biopsja fazy rozszczepiania (blastomere biopsy)Edytuj

biopsja fazy rozszczepiania jest zazwyczaj wykonywana rano trzeciego dnia po zapłodnieniu, gdy normalnie rozwijające się zarodki osiągają Stadium ośmiokomórkowe. Biopsja jest zwykle wykonywana na zarodkach z mniej niż 50% fragmentów bezjądrowych i na 8-komórkowym lub późniejszym etapie rozwoju. Otwór jest wykonany w zona pellucida i jeden lub dwa blastomery zawierające jądro są delikatnie zasysane lub wytłaczane przez otwór.Główną zaletą biopsji w fazie rozszczepiania nad analizą PB jest to, że można badać wkład genetyczny obojga rodziców. Z drugiej strony stwierdzono, że zarodki w fazie rozszczepiania mają wysoki wskaźnik mozaiki chromosomalnej, co stawia pod znakiem zapytania, czy wyniki uzyskane na jednym lub dwóch blastomerach będą reprezentatywne dla reszty zarodka. Z tego powodu niektóre programy wykorzystują kombinację biopsji PB i biopsji blastomerowej. Ponadto biopsja na etapie rozszczepiania, podobnie jak w przypadku biopsji PB, daje bardzo ograniczoną ilość tkanki do rozpoznania, co wymaga opracowania jednokomórkowego PCR i technik FISH.Chociaż teoretycznie biopsja PB i biopsja blastocysty są mniej szkodliwe niż biopsja w fazie rozszczepiania, nadal jest to powszechna metoda. Jest on stosowany w około 94% cykli PGD zgłoszonych Konsorcjum ESHRE PGD. Głównym powodem jest to, że pozwala na bezpieczniejszą i pełniejszą diagnozę niż biopsja PB i nadal pozostawia wystarczająco dużo czasu, aby zakończyć diagnozę, zanim zarodki muszą zostać zastąpione w macicy pacjenta, w przeciwieństwie do biopsji blastocysty.Ze wszystkich etapów rozszczepiania, jest ogólnie uzgodnione, że optymalny moment do biopsji jest na etapie ośmiu komórek. Jest ona bezpieczniejsza diagnostycznie niż biopsja PB i w przeciwieństwie do biopsji blastocysty pozwala na rozpoznanie zarodków przed 5. dniem. Na tym etapie komórki są nadal totipotentne, a zarodki nie są jeszcze zagęszczane. Chociaż wykazano, że do jednej czwartej ludzkiego zarodka można usunąć bez zakłócania jego rozwoju, nadal pozostaje do zbadania, czy biopsja jednej lub dwóch komórek koreluje ze zdolnością zarodka do dalszego rozwoju, implantacji i wzrostu do pełnej ciąży.

nie wszystkie metody otwierania zona pellucida mają taki sam wskaźnik skuteczności, ponieważ procedura stosowana do biopsji może mieć wpływ na dobre samopoczucie zarodka i/lub blastomeru. Zbadano wiercenie strefą roztworem kwasu Tyrodowego (ZD) w porównaniu do częściowego rozwarstwienia strefy (PZD) w celu określenia, która technika doprowadziłaby do bardziej udanych ciąż i miała mniejszy wpływ na zarodek i/lub blastomerę. ZD wykorzystuje enzym trawienny, taki jak pronaza, co czyni go chemiczną metodą wiercenia. Chemikalia stosowane w ZD mogą mieć szkodliwy wpływ na zarodek. PZD używa mikroigła szklanego do cięcia zona pellucida, co czyni go mechaniczną metodą rozwarstwienia, która zazwyczaj wymaga wykwalifikowanych rąk do wykonania zabiegu. W badaniu obejmującym 71 par ZD wykonano w 26 cyklach z 19 par, a PZD w 59 cyklach z 52 par. W analizie jednokomórkowej wskaźnik sukcesu wyniósł 87,5% w grupie PZD i 85,4% w grupie ZD. Wiek matki, liczba pobranych oocytów, stopień zapłodnienia i inne zmienne nie różniły się między grupami ZD i PZD. Stwierdzono, że PZD prowadziło do znacznie wyższego wskaźnika ciąży (40,7% vs 15,4%), trwającej ciąży (35,6% vs 11,5%) i implantacji (18,1% vs 5,7%) niż ZD. Sugeruje to, że zastosowanie metody mechanicznej PZD w biopsjach blastomerowych w diagnostyce genetycznej przedimplantacyjnej może być bardziej biegłe niż zastosowanie metody chemicznej ZD. Sukces PZD nad ZD może być przypisany do czynnika chemicznego w ZD mającego szkodliwy wpływ na zarodek i / lub blastomere. Obecnie dominującą metodą otwierania zona pellucida jest wiercenie za pomocą lasera. Korzystanie z lasera jest łatwiejszą techniką niż przy użyciu środków mechanicznych lub chemicznych. Jednak wiercenie laserowe może być szkodliwe dla zarodka i jest bardzo kosztowne dla laboratoriów zapłodnienia in vitro, zwłaszcza gdy PGD nie jest powszechnym procesem w dzisiejszych czasach. PZD może być realną alternatywą dla tych problemów.

biopsje Blastocystyedit

próbując przezwyciężyć trudności związane z technikami jednokomórkowymi, zasugerowano biopsję zarodków na etapie blastocysty, zapewniając większą ilość materiału wyjściowego do diagnozy. Wykazano, że jeśli więcej niż dwie komórki są obecne w tej samej probówce, główne problemy techniczne jednokomórkowego PCR lub ryb praktycznie znikną. Z drugiej strony, podobnie jak w przypadku biopsji na etapie rozszczepiania, różnice chromosomowe między wewnętrzną masą komórek a trofektodermą (te) mogą zmniejszać dokładność diagnozy, chociaż ten mozaicyzm był donoszony jako niższy niż w zarodkach na etapie rozszczepiania.

biopsja TE okazała się skuteczna w modelach zwierzęcych, takich jak króliki, myszy i naczelne. Badania te wykazują, że usunięcie niektórych komórek TE nie jest szkodliwe dla dalszego rozwoju zarodka in vivo.

biopsję w stadium blastocysty dla PGD wykonuje się wykonując dziurę w ZP w trzecim dniu hodowli in vitro. Pozwala to na wystawienie rozwijającego się TE po blastulacji, ułatwiając biopsję. W piątym dniu po zapłodnieniu około pięć komórek zostaje wyciętych z TE za pomocą szklanej igły lub energii lasera, pozostawiając zarodek w dużej mierze nienaruszony i bez utraty wewnętrznej masy komórek. Po rozpoznaniu zarodki mogą być zastąpione w tym samym cyklu lub krioprezerwowane i przeniesione w kolejnym cyklu.

istnieją dwie wady tego podejścia, ze względu na etap, na którym jest ono wykonywane. Po pierwsze, tylko około połowa zarodków przedimplantacyjnych osiąga stadium blastocysty. Może to ograniczyć liczbę blastocyst dostępnych do biopsji, ograniczając w niektórych przypadkach sukces PGD. Mc Arthur i współpracownicy donoszą, że 21% rozpoczętych cykli PGD nie miało zarodka nadającego się do biopsji TE. Liczba ta jest około cztery razy wyższa od średniej przedstawionej w danych konsorcjum ESHRE PGD, gdzie PB i biopsja w fazie rozszczepiania są głównymi metodami opisanymi. Z drugiej strony, opóźnienie biopsji do tak późnego stadium rozwoju ogranicza czas na wykonanie diagnozy genetycznej, utrudniając ponowne wykonanie drugiej tury PCR lub rehybridyzację sond ryb, zanim zarodki zostaną przeniesione z powrotem do pacjenta.

cumulus cell samplingEdit

pobieranie próbek komórek cumulus może być wykonywane oprócz pobierania próbek ciał polarnych lub komórek z zarodka. Ze względu na molekularne interakcje między komórkami cumulus a oocytem, profilowanie ekspresji genów komórek cumulus może być wykonywane w celu oszacowania jakości oocytów i skuteczności protokołu hiperstymulacji jajników i może pośrednio przewidywać aneuploidię, rozwój zarodka i wyniki ciąży.

nieinwazyjne metody Preimplantacyjnego badania genetycznego (NIPG)Edytuj

tradycyjna biopsja zarodka może być inwazyjna i kosztowna. W związku z tym, naukowcy mają ciągłe dążenie do znalezienia mniej inwazyjnych metod preimplantacyjnych badań genetycznych. Badania nad nowymi nieinwazyjnymi metodami genetycznego przesiewania przedimplantacyjnego (NIPG), takimi jak płyn blastocoelowy i zużyte pożywki zarodkowe, zostały niedawno opublikowane jako alternatywa dla tradycyjnych metod

genetyczne badania przesiewowe Przedimplantacyjne z użyciem płynu Blastocoelowego (BF)podczas normalnego procesu IVF, dobra praktyka witryfikacji zarodków zwiększa szansę na zdrową ciążę. Podczas procesu witryfikacji rozwinięty blast jest odwodniony, a on i jego Wnęka blastocoel zapadają się w procesie zamrażania. Istnieje wiele metod, które zostały wykorzystane w celu ułatwienia upadku, w tym impulsu laserowego, wielokrotnego mikropipetowania, nakłucia mikroigła lub mikrosukcji normalnie płyn ten zostanie odrzucony, jednak przy preimplantacyjnych testach genetycznych BL, płyn ten jest zapisywany, a następnie testowany na DNA. Uważa się, że DNA to pochodzi z komórek, które przeszły apoptozę, znajdujących się w rozwijającym się zarodku

Preimplantacyjne badania genetyczne z wykorzystaniem pożywki uwarunkowanej hodowlą Blastocystów (BCCM)inna metoda mniej inwazyjnych preimplantacyjnych badań genetycznych obejmuje badanie pożywki hodowlanej, w której rozwinął się zarodek. Zauważono, że zarodek uwalnia fragmenty DNA z komórek, które obumarły w okresie inkubacji. Dzięki tej wiedzy naukowcy uznali, że mogą wyizolować to DNA i użyć go do preimplantacyjnych testów genetycznych

korzyści i konsekwencje mniej inwazyjnych przedimplantacyjnych testów genetycznychgdy istnieją sprzeczne dowody na to, czy bardziej tradycyjne metody preimplantacyjnych testów genetycznych są szkodliwe dla zarodka, istnieją nowsze metody dla mniej inwazyjnych i równie skutecznych metod testowania. W tym celu przeszliśmy do preimplantacyjnych testów genetycznych z użyciem płynu blastocoelowego i zużytego pożywki zarodkowej. Jednym z problemów tych alternatyw jest minimalna ilość DNA, z którą można pracować. Kolejnym bardzo ważnym pytaniem jest to, czy ta technologia jest dokładna. Oba te problemy zostały niedawno rozwiązane przez Kuzniecowa. Kuznyetsov postanowił użyć obu metod łączących ilość DNA pobranego z obu technik. Następnie po wyizolowaniu DNA wykorzystano go do preimplantacyjnych badań genetycznych. Wyniki wykazały, że gdy obie metody blastocyst płyn i zarodek zużyte Media były stosowane w połączeniu wykazały szybkość cordance dla całej kopii chromosomu 87.5% w porównaniu do trofektodermy, 96,4% w porównaniu do całej blastocysty (złoty standard). Dodatkowo po amplifikacji za pomocą tej nowej metody byli w stanie wytworzyć 25,0-54,0 ng/ul DNA na próbkę. Dzięki tradycyjnym metodom, takim jak trophektoderm, zebrano od 10 do 44 ng/ul

techniki analizy Genetycznejedit

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) i reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) są dwoma powszechnie stosowanymi technologiami pierwszej generacji w PGD. PCR jest zwykle stosowany do diagnozowania zaburzeń monogennych, a FISH jest używany do wykrywania nieprawidłowości chromosomalnych (na przykład badania aneuploidii lub translokacji chromosomów). W ciągu ostatnich kilku lat różne postępy w testowaniu PGD pozwoliły na poprawę kompleksowości i dokładności dostępnych wyników w zależności od zastosowanej technologii. Ostatnio opracowano metodę pozwalającą na mocowanie płytek metafazowych z pojedynczych blastomerów. Technika ta w połączeniu z FISH, M-FISH może produkować bardziej wiarygodne wyniki, ponieważ analiza odbywa się na całych płyt metafazowych

oprócz FISH i PCR, sekwencjonowanie genomu pojedynczej komórki jest testowany jako metoda preimplantacji diagnozy genetycznej. To charakteryzuje kompletną sekwencję DNA genomu zarodka.

FISHEdit

ryba jest najczęściej stosowaną metodą określania budowy chromosomowej zarodka. W przeciwieństwie do kariotypowania, może być stosowany na chromosomach międzyfazowych, dzięki czemu może być stosowany na próbkach PBs, blastomerów i TE. Komórki są utrwalane na szklanych szkiełkach mikroskopowych i hybrydyzowane za pomocą sond DNA. Każda z tych sond jest specyficzna dla części chromosomu i jest oznaczona fluorochromem.

Dual FISH została uznana za skuteczną technikę określania płci ludzkich zarodków przedimplantacyjnych i dodatkowej zdolności do wykrywania nieprawidłowej liczby kopii chromosomów, co nie jest możliwe dzięki łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR).

obecnie dostępny jest duży panel sond dla różnych segmentów wszystkich chromosomów, ale ograniczona liczba różnych fluorochromów ogranicza liczbę sygnałów, które mogą być analizowane jednocześnie.

rodzaj i liczba sond, które są używane na próbce, zależy od wskazania. W celu określenia płci (stosowane na przykład, gdy Protokół PCR dla danego zaburzenia związanego z X nie jest dostępny), sondy dla chromosomów X i Y są stosowane wraz z sondami dla jednego lub więcej autosomów jako wewnętrzna kontrola ryb. Można dodać więcej sond, aby sprawdzić obecność aneuploidów, szczególnie tych, które mogą spowodować żywotną ciążę (np. trisomia 21). Zastosowanie sond do chromosomów X, Y, 13, 14, 15, 16, 18, 21 i 22 ma potencjał wykrycia 70% aneuploidów występujących w spontanicznych aborcjach.

aby móc analizować więcej chromosomów na tej samej próbce, można przeprowadzić do trzech kolejnych rund ryb. W przypadku rearanżacji chromosomów należy wybrać określone kombinacje sond, które otaczają interesujący region. Uważa się, że poziom błędu w technice ryb wynosi od 5 do 10%.

głównym problemem wykorzystania ryb do badania budowy chromosomowej zarodków jest podwyższony wskaźnik mozaiki obserwowany na etapie preimplantacji człowieka. Metaanaliza ponad 800 zarodków wykazała, że około 75% zarodków przedimplantacyjnych to mozaiki, z czego około 60% to mozaiki diploidalno–aneuploidalne, a około 15% to mozaiki aneuploidalne. Li i współpracownicy odkryli, że 40% embrionów zdiagnozowanych jako aneuploid w dniu 3 okazało się mieć euploidalną masę komórek wewnętrznych w dniu 6. Staessen i współpracownicy odkryli, że 17,5% embrionów zdiagnozowanych jako nieprawidłowe podczas PGS i poddanych ponownej analizie po PGD, okazało się również zawierać normalne komórki, a 8,4% stwierdzono rażąco normalne. W konsekwencji kwestionowano, czy jedna lub dwie komórki badane z embrionu są rzeczywiście reprezentatywne dla całego embrionu i czy żywotne embriony nie są odrzucane z powodu ograniczeń techniki.

PCREdit

Kary Mullis opracował PCR w 1985 roku jako uproszczoną reprodukcję in vitro procesu replikacji DNA in vivo. Wykorzystując właściwości chemiczne DNA i dostępność termostabilnych polimeraz DNA, PCR pozwala na wzbogacenie próbki DNA dla określonej sekwencji. PCR zapewnia możliwość uzyskania dużej ilości kopii danego odcinka genomu, co umożliwia dalszą analizę. Jest to bardzo wrażliwa i specyficzna technologia, która sprawia, że nadaje się do wszelkiego rodzaju diagnostyki genetycznej, w tym PGD. Obecnie istnieje wiele różnych odmian samego PCR, a także różnych metod analizy tylnej produktów PCR.

stosując PCR w PGD, mamy do czynienia z problemem, który nie występuje w rutynowej analizie genetycznej: najmniejsze ilości dostępnego genomowego DNA. Ponieważ PGD jest wykonywane na pojedynczych komórkach, PCR musi zostać zaadaptowany i popchnięty do swoich fizycznych granic, i użyć minimalnej możliwej ilości szablonu: która jest jedną nicią. Oznacza to długi proces dostrajania warunków PCR i podatność na wszystkie problemy konwencjonalnego PCR, ale kilka stopni zintensyfikowane. Duża liczba potrzebnych cykli PCR i ograniczona ilość szablonu sprawia, że jednokomórkowy PCR jest bardzo wrażliwy na zanieczyszczenia. Innym problemem specyficznym dla jednokomórkowego PCR jest zjawisko wypadania alleli (ADO). Polega ona na losowym braku amplifikacji jednego z alleli obecnych w próbce heterozygotycznej. ADO poważnie podważa wiarygodność PGD, ponieważ heterozygotyczny zarodek może zostać zdiagnozowany jako dotknięty lub nienaruszony, w zależności od tego, który allel nie ulegnie wzmocnieniu. Dotyczy to zwłaszcza PGD w przypadku zaburzeń autosomalnych dominujących, w których ADO dotkniętego allelu może prowadzić do przeniesienia chorego embrionu.

opracowano kilka testów opartych na PCR dla różnych chorób, takich jak geny powtórzeń triplet związanych z dystrofią miotoniczną i kruchym X w pojedynczych ludzkich komórkach somatycznych, gametach i zarodkach.

NGSEdit

od 2014 r.w PGT przeprowadza się sekwencjonowanie nowej generacji (NGS). NGS, znany również jako masywne równoległe sekwencjonowanie, jest grupą technik zdolnych do sekwencjonowania dużych ilości DNA przy rozsądnych kosztach i czasie. Może dać nam ogólną perspektywę pełnego genomu zarodka, w tym mitochondrialnego. Techniki te opierają się na sekwencjonowaniu krótkich odczytów wokół baz 400 i nakładaniu się tych odczytów za pomocą potężnego oprogramowania do wyrównywania.

podobnie, NGS pozwala nam również wykryć aneuploidy w 24 chromosomach i defektach jednogenowych, gdy istnieją wskazania od rodziców nosicieli. Główną zaletą jest to, że NGS może łączyć wykrywanie zarówno aneuploidów, jak i chorób monogennych z jedną biopsją i obniża przystępne koszty, czyniąc ją bardziej dostępną.

dwa przykłady NGS to pirosekwencja i odwracalny Terminator barwnika.

ustalenie diagnozyedytuj

ustalenie diagnozy w PGD nie zawsze jest proste. Kryteria stosowane przy wyborze zarodków do zastąpienia po wynikach Fish lub PCR nie są jednakowe we wszystkich ośrodkach.W przypadku ryb, w niektórych ośrodkach zastępowane są tylko zarodki, które są chromosomalnie normalne (tzn. wykazują dwa sygnały dla gonosomów i analizowanych autosomów) po analizie jednego lub dwóch blastomerów, a gdy analizuje się dwa blastomery, wyniki powinny być zgodne. Inne ośrodki argumentują, że zarodki diagnozowane jako monosomowe mogą być przenoszone, ponieważ fałszywa monosomia (tj. utrata jednego sygnału ryb w normalnej komórce diploidalnej) jest najczęściej występującą błędną diagnozą. W takich przypadkach nie ma ryzyka zajścia w ciążę aneuploidalną, a normalne zarodki diploidalne nie są tracone do przeniesienia z powodu błędu ryby. Co więcej, wykazano, że zarodki zdiagnozowane jako monosomowe w dniu 3 (z wyjątkiem chromosomów X i 21) nigdy nie rozwijają się do blastocysty, co koreluje z faktem, że te monosomy nigdy nie są obserwowane w trwającej ciąży.

Diagnostyka i błędna diagnoza w PGD przy użyciu PCR zostały matematycznie modelowane w pracach Navidiego i Arnheima oraz Lewisa i współpracowników. Najważniejszym wnioskiem tych publikacji jest to, że do skutecznej i dokładnej diagnozy zarodka wymagane są dwa genotypy. Może to być oparte na powiązanym markerze i genotypach choroby z pojedynczej komórki lub na genotypach markera/choroby z dwóch komórek. Interesującym aspektem badanym w tych pracach jest szczegółowe badanie wszystkich możliwych kombinacji alleli, które mogą pojawić się w wynikach PCR dla konkretnego zarodka. Autorzy wskazują, że niektóre genotypy, które można uzyskać podczas diagnozy, mogą nie być zgodne z oczekiwanym wzorcem powiązanych genotypów markerowych, ale nadal zapewniają wystarczającą pewność co do nienaruszonego genotypu zarodka. Chociaż modele te są uspokajające, opierają się na modelu teoretycznym i generalnie diagnoza jest ustalana na bardziej konserwatywnych zasadach, mając na celu uniknięcie możliwości błędnej diagnozy. Gdy podczas analizy komórki pojawiają się nieoczekiwane allele, w zależności od obserwowanego genotypu, uważa się, że albo przeanalizowano nieprawidłową komórkę, albo doszło do zanieczyszczenia i nie można ustalić diagnozy. Przypadek, w którym nieprawidłowość analizowanej komórki może być wyraźnie zidentyfikowana, to przypadek, w którym przy użyciu multipleksu PCR dla połączonych markerów w próbce znajdują się tylko allele jednego z rodziców. W tym przypadku komórka może być uważana za posiadającą monosomię chromosomu, na którym znajdują się markery, lub, ewentualnie, za haploidalną. Pojawienie się pojedynczego allelu, który wskazuje na dotknięty genotyp jest uważany za wystarczający do zdiagnozowania zarodka jako dotkniętego, a zarodki, które zostały zdiagnozowane z pełnym nienaruszonym genotypem, są preferowane do wymiany. Chociaż ta polityka może prowadzić do mniejszej liczby nienaruszonych zarodków nadających się do przeniesienia, uważa się, że jest ona bardziej korzystna niż możliwość błędnej diagnozy.

preimplantacja genetyczna haplotypingEdit

Preimplantacja genetyczna haplotyping (PGH) jest techniką PGD, w której identyfikuje się haplotyp markerów genetycznych, które mają statystyczne skojarzenia z chorobą docelową, a nie mutację powodującą chorobę.

Po ustaleniu panelu powiązanych markerów genetycznych dla danej choroby można go stosować u wszystkich nosicieli tej choroby. W przeciwieństwie do tego, ponieważ nawet choroba monogenowa może być spowodowana wieloma różnymi mutacjami w obrębie dotkniętego genu, konwencjonalne metody PGD oparte na znalezieniu konkretnej mutacji wymagałyby testów specyficznych dla mutacji. W ten sposób PGH rozszerza dostępność PGD do przypadków, w których testy specyficzne dla mutacji są niedostępne.

PGH ma również przewagę nad rybami, ponieważ ryby zwykle nie są w stanie dokonać rozróżnienia między zarodkami, które posiadają zrównoważoną formę translokacji chromosomowej, a tymi, które niosą homologiczne normalne chromosomy. Ta niezdolność może być poważnie szkodliwa dla postawionej diagnozy. PGH potrafi rozróżnić, że ryby często nie potrafią. PGH robi to za pomocą markerów polimorficznych, które lepiej nadają się do rozpoznawania translokacji. Te polimorficzne markery są w stanie odróżnić zarodki, które prowadziły normalne, zrównoważone i niezrównoważone translokacje. Ryby wymagają również więcej fiksacji komórek do analizy, podczas gdy PGH wymaga tylko przeniesienia komórek do rurek reakcji łańcuchowej polimerazy. Transfer komórek jest prostszą metodą i pozostawia mniej miejsca na niepowodzenie analizy.

transfer zarodka i kriokonserwacja nadmiaru zarodkaedytuj

transfer zarodka jest zwykle wykonywany w trzecim lub piątym dniu po zapłodnieniu, w zależności od technik stosowanych w PGD i standardowych procedur centrum IVF, w którym jest wykonywany.

wraz z wprowadzeniem w Europie polityki transferu pojedynczego zarodka, która ma na celu zmniejszenie częstości ciąż mnogich po ART, zwykle jeden zarodek lub wczesna blastocysta jest zastępowana w macicy. HCG w surowicy jest oznaczane w dniu 12. W przypadku stwierdzenia ciąży wykonuje się badanie ultrasonograficzne w 7 tygodniu w celu potwierdzenia obecności bicia serca płodu. Zazwyczaj zaleca się parom poddanie się PND ze względu na, choć niskie, ryzyko błędnej diagnozy.

nie jest niczym niezwykłym, że po PGD jest więcej zarodków odpowiednich do przeniesienia z powrotem do kobiety niż to konieczne. Dla par poddawanych PGD zarodki te są bardzo cenne, ponieważ obecny cykl pary może nie prowadzić do trwającej ciąży. Kriokonserwacja zarodków, a następnie rozmrażanie i wymiana mogą dać im drugą szansę na ciążę bez konieczności ponownego wykonywania uciążliwych i kosztownych zabiegów ART i PGD.