Tak polymerase er et af de mest allestedsnærværende tegn inden for molekylærbiologi. Siden opdagelsen i 19651 er det blevet rygraden i PCR og alle de nedstrøms applikationer, som teknologien muliggør. Denne kraftfulde polymerase er standard valg for de fleste amplifikation og kloning procedurer, samt diagnostiske tests, markør gen DNA-sekventering, og meget mere.

Hvad er det, der gør polymerase så speciel? I dagens artikel vil vi se på fordele og ulemper ved Tak, hvad du har brug for for at få de bedste PCR-resultater fra tak polymerase og nogle Tak-derivater, der kan hjælpe dig med at opnå bedre resultater til specialiserede applikationer.

Hvorfor er det så almindeligt anvendt til PCR?

taks Popularitet drager fordel af, at det var den første højtemperaturpolymerase opdaget af molekylærbiologer. Men det er langt fra den eneste grund til, at det stadig er i så høj efterspørgsel i dag.polymerase har den vigtige egenskab at være stabil ved temperaturer op til 95 liter C2. Det er kritisk, fordi det er den temperatur, hvor DNA denaturerer – et nødvendigt trin i begyndelsen af PCR-reaktionen. Mens enhver polymerase med moderat temperatur også denaturerer ved den temperatur, hvilket gør den ubrugelig, forbliver Tak perfekt klar til at begynde at polymerisere din mål-DNA-prøve.

på toppen af det har Tak den fordel at være mest aktiv i 70-80 liter C temperaturområde2. Det er varmt nok, at DNA ikke vil reanneal, men primere, der har udglødet ved lavere temperaturer, vil heller ikke skrælle af. Så, tak polymerase fungerer ekstremt godt ved de temperaturer, som de fleste standard PCR-reaktioner kræver.

endelig passer tak til grundlæggende molekylærbiologiske behov ekstremt godt. Polymerasen efterlader a-tailed produkter, som let kan klones til en vektor ved hjælp af et standard TA-kloningssæt. Det er også relativt modstandsdygtigt over for DNA-sekvenser med en bred vifte af GC-indhold og er ikke så kræsen med hensyn til mål-DNA-eller dNTP-koncentrationer.

Hvad skal der til for at polymerisere effektivt?

Hvis du blot tilføjede tak polymerase alene til en prøve af DNA, ville der ikke ske meget. Det skyldes, at vi som de fleste andre har brug for en specialiseret blanding af reagenser for at kunne fungere korrekt.

den grundlæggende tak-buffer inkluderer kaliumchlorid, Tris-hydrochlorid og Triton-100. Disse kemikalier er mindre relevante for at optimere dine PCR – reaktioner end for at holde dem sikre under opbevaring i fryseren-hvilket i sig selv er vigtigt for at få mest muligt ud af dine PCR ‘ er. Mens du kan lave din egen buffer til at rehydrere og opbevare lyofiliseret Tak, sælges langt størstedelen af polymerase som en Masterblanding med tak, der allerede er suspenderet i den krævede bufferopløsning.

mere kritisk for dine PCR-reaktioner er magnesiumchlorid. Magnesium er en vigtig cofaktor for tak polymerase3. Uden det vil vi ikke være i stand til at katalysere tilsætningen af nukleotider til primeren eller voksende DNA-streng. Koncentrationen af magnesium betyder også noget. Da der tilsættes mere magnesium til en PCR-reaktion, bliver Tak mere aktiv, men også mindre specifik i polymerisering af kun din mål-DNA-streng.

på grund af den koncentrationsafhængige rolle magnesium, kan du finde Tak master blandinger med magnesium allerede inkluderet samt blandinger, der udelader det. I sidstnævnte tilfælde skal du tilføje magnesiumchlorid separat (hvilket kræver et ekstra pipetteringstrin, når du forbereder dine PCR ‘ er). Fordelen er, at du kan kontrollere den nøjagtige koncentration af magnesium, så du kan eksperimentere for at finde den mest optimale blanding af Tak produktivitet og specificitet.

Hvad er problemerne med Tak Polymerase?

Tak bruges i vid udstrækning til rutinemæssige PCR ‘ er, men det er desværre ikke perfekt til alle applikationer. Den mest bemærkelsesværdige ulempe er, at det ikke er den mest præcise polymerase derude. 100.000 basispar 4. Til sammenligning er PFU korrekturlæsning polymerase omkring 10 gange mere præcis. Hvis du bruger PCR opstrøms for kloning eller DNA-sekventering, kan denne forskel i fejlfrekvens være meget signifikant.standard Tak-polymerase kan også have problemer med at forstærke mål-DNA-sekvenser længere end ca.1 kB. I forhold til andre typer polymeraser har Tak lav processivitet, hvilket betyder, at dens effektivitet falder markant med længden af din amplicon. Denne lave processivitet kan forværres ved tilstedeværelsen af PCR-hæmmere, som er almindelige, hvis du arbejder med DNA ekstraheret fra væv, planter eller jord.når temperaturen i din PCR-reaktion falder for at tillade primere at annealere til din målsekvens, er det problematisk, fordi tak kan utilsigtet polymerisere primere eller ikke-mål-DNA-sekvenser, når temperaturen i din PCR-reaktion falder for at give primere mulighed for at annealere til din målsekvens. Som et resultat er det kendt, at vi producerer primerdimerer og andre uønskede produkter, der kan komme i vejen for nedstrøms applikationer som kloning.

specialiserede Tak-polymeraser til avancerede applikationer

heldigvis er der specialiserede former for tak-polymerase, der løser nogle af disse problemer. F. eks.er polymerase en syntetisk version af tak, der har mere processivitet end standard Tak. Som et resultat kan du lettere opnå amplicon-udbytter fra skabeloner med høj GC, skabeloner længere end 1 kB i længden og prøver med moderate koncentrationer af hæmmere.

en anden almindelig form for tak, som ALLin Hot Start Tak, er konstrueret med en molekylær hæmmer for at gøre den inaktiv ved lavere temperaturer. Varmstart er kun funktionel efter opvarmning til 95 liter C. Det reducerer dramatisk dannelsen af primerdimerer og ikke-specifikke amplikoner som et resultat af polymerisering inden starten af dine PCR-reaktioner. Som et resultat kan du få højere udbytter, når du arbejder med længere målsekvenser og skære ned på baggrundsforstærkere, der normalt kræver oprydning.

konklusion

tak polymerase har længe været det foretrukne valg til både rutinemæssige og komplekse PCR-applikationer. Det passer perfekt til kravene i PCR-reaktionen, samtidig med at nedstrøms applikationer som kloning og sekventering er enkle. Selvom standard Tak har nogle ulemper, løses disse stort set ved hjælp af en konstrueret eller varm start Tak polymerase. For langt de fleste applikationer forbliver tak polymerase go-to for molekylærbiologer.

1 Ishino S, Ishino Y. 2014. Grænser i mikrobiologi 5: 465.

2 Coleman VB, Tsongalis GJ. 2017. Diagnostisk molekylær patologi: en Guide til anvendt molekylær test.

3 Michael M. 2018. Videnskab

4 McInerney, Adams P, Hadi MS. 2014. Molekylærbiologi International 287430.