I. U. B.: 2.7.7.7
C. A. S.: 9012-90-2
polymerisering

DNA polymerase i deltager I DNA-replikation af prokaryoter. DNA kædevækst er i 5′ til 3′ retning med tilsætning ved 3 ‘ hydroksyl ende. Den nye kæde er baseparret med skabelonen, og den nye kæde og skabelon er antiparallel. DNA-polymerase i er den mest rigelige polymerase og fungerer til at udfylde huller i DNA, der opstår under DNA-replikation, reparation og rekombination.

historie:

DNA-polymerase i blev opdaget af Arthur Kornberg et al. i 1956. Hans første resultater blev først præsenteret på det årlige møde i 1956 Federation of American Societies for eksperimentel biologi (FASEB) i Atlantic City, ny trøje. Anmeldere af hans oprindelige papir foreslog, at forfatterne henviser til produktet som’ polydeoksyribonukleotid ‘snarere end’DNA’; ‘DNA’ blev først godkendt efter en appel til chefredaktøren, John Edsall (Friedberg 2006). Yderligere to papirer blev offentliggjort i 1958 af Lehman et al. Bessman et al., som definitivt etablerede DNA-polymerase udførte DNA-replikation. Kornberg blev tildelt Nobelprisen i 1959 for sin opdagelse af DNA-polymerase I.

i 1969, Jovin et al. belyst aminosyresammensætningen (Jovin et al. 1969a, b). Samme år isolerede DeLucia og Cairns en E. coli-stamme med en mutation, der påvirkede DNA-polymerasen og overraskende fandt, at mutanten syntetiserede DNA normalt. Denne opdagelse rejste tvivl om DNA-polymerases rolle i replikation og fik grupper til at søge efter andre replikationssymboler. Samtidig viste Klenov og kolleger, at behandlingen af DNA-polymerase med proteolytisk subtilisin (Type Carlsberg) resulterede i en stigning i polymeraseaktivitet og fald i eksonukleaseaktivitet. Den resulterende DNA-polymerase blev isoleret og fik navnet “klenufragmentet” (Klenufragmentet 1970a, Klenufragmentet og Overgaard-Hansen 1970).

i 1970 blev DNA-polymerase II af E. coli isoleret og karakteriseret af Arthur Kornbergs søn, Thomas Kornberg (Kornberg og Gefter 1970). DNA-polymerase II blev også uafhængigt rapporteret af Knippers og af Moses og Richardson i 1970 (Moses og Richardson 1970b). Et år senere identificerede Thomas Kornberg og Gefter DNA-polymerase III (Kornberg og Gefter 1971).

nyligt arbejde med DNA-polymerase I har inkluderet undersøgelse af det molekylære grundlag for substratspecificitet gennem termodynamiske undersøgelser. 2010) og single-molecule FRET eksperimenter (Santoso et al. 2010). Hastings et al. har undersøgt interaktionerne mellem de fem E. coli DNA-polymeraser under cellulær stress (Hastings et al. 2010), og Kukreti et al.undersøgelser har til formål at bestemme, hvilke rester der er vigtige for 3′-5′ eksonukleaseaktivitet (Kukreti et al. 2008).

specificitet:DNA-syntese kræver en primerstreng med en fri 3′-hydroksylterminal udglødet til en DNA-skabelonstreng, og deoksynukleotidtriphosphaterne danner basepar med skabelonen. Tilsætning er i 5′ til 3 ‘ retning med frigivelse af pyrophosphat. Den er aktiv med DNA ‘er, der indeholder enkeltstrengede huller og også med DNA’ er med enkeltstrengede pauser eller hak. Under visse betingelser kan RNA-DNA-hybrider og en RNA-dupleks tjene som skabelon-primer (Setlav 1972).

den 5′ til 3′ eksonukleaseaktivitet, der er forbundet med DNA-polymerase i, nedbryder både enkelt-og dobbeltstrenget DNA i retningen 5′ til 3′, hvilket giver 5′ – mononukleotider. 5′ til 3’eksonukleaseaktiviteten er specifik for dobbeltstrenget DNA, hvilket giver 5′ -mononukleotider og oligonukleotider. DNA-polymerase I kan også punge uoverensstemmende regioner i DNA (Setlav 1972).den tilsvarende struktur af DNA-polymeraser har vist, at de fleste DNA-polymeraser anvender en identisk to-metalionkatalyseret polymerasemekanisme. En metalion aktiverer primerens 3 ‘- OH til angreb på dNTP ‘ s a-fosfat. Den anden metalion stabiliserer den negative ladning af det forlader ilt og chelaterer b – og g-fosfaterne (1999). fragmentet er et proteolytisk produkt af E. coli DNA-polymerase i, der bevarer polymerisering og 3′ til 5′ eksonukleaseaktivitet, men har mistet 5’ til 3 ‘ eksonukleaseaktivitet.

sammensætning:

DNA-polymerase I er det dominerende polymeriserende stof, der findes i E. coli. Den indeholder en enkelt disulfidbinding og en sulfhydrylgruppe (Jovin et al. 1969b). Fem forskellige DNA-polymeraser er blevet isoleret fra E. coli og er blevet betegnet I, II, III, IV og V. DNA-polymerase i Fungerer til at udfylde DNA-huller, der opstår under DNA-replikation, reparation og rekombination. DNA-polymerase II fungerer også i redigering og korrekturlæsning hovedsageligt i den tilbagestående streng (Kim et al. 1997 og Nohmi 2000). DNA-polymerase III er det vigtigste replikative middel. DNA-polymerase IV og V har store aktive steder, der giver mulighed for mere base misincorporation, og er derfor mere fejlbehæftet. De mangler også korrekturlæsning-eksonukleaseunderenheder for at korrigere misincorporations (Nohmi 2006 og Hastings et al. 2010). DNA-polymerase V er kun til stede på signifikante niveauer i SOS-inducerede celler, og overekspression begrænser DNA-syntese (Marsh og rollator 1985).

domæneformen for alle polymeraser, hvis strukturer er kendt, er blevet beskrevet som en “højre hånd” med “tommelfinger”, “håndflade” og “finger” domæner (Kohlstaedt et al. 1992). Palme-regionen menes at katalysere phosphoryloverførslen, og fingerregionen menes at interagere med det indkommende nukleosid-triphosphat og den skabelonbase, den er parret til. Tommelfingeren menes at hjælpe med at placere DNA ‘ et og i translokation (Brautigam og Steitsa 1998).

molekylære egenskaber:

genet, der koder for DNA-polymerase i (polA), indeholder ca.3.000 basepar og koder for ca. 1.000 aminosyrerester i en simpel polypeptidkæde. Selv organismer adskilt af en milliard års evolution (såsom Deinococcus-Thermus slægter og E. coli) har ca. 35% aminosyreidentitet og ca.50% homologi (Patel et al. 2001).

Proteintiltrædelsesnummer: P00582

molekylvægt:

• 109 kDa (Jovin et al. 1969a, b)
• klenov fragment: 70 kDa (gelfiltrering, Klenov og Overgaard-Hansen 1970)

Optimal pH:

• maksimal aktivitet opnås ved pH 7,4 med kaliumphosphatbuffer til native DNA-eller poly dat-skabelonprimer-systemer (Richardson et al. 1964)
• klenufragment: maksimale aktiviteter opnås ved 7,4 med fosfatbuffer og ved 8.4 med Tris-HCl-buffer

isoelektrisk punkt:

• 5.40 (teoretisk)

Udryddelseskoefficient:

aktivatorer:

• en divalent kation er påkrævet for aktivitet
• Mg2+ ved en koncentration på 7 mM giver optimal aktivitet under betingelserne i standardanalysen (Richardson et al. 1964)
• Mn2 + kan delvist opfylde metalionkravet
• aktivitet påvirkes også af koncentrationer af monovalente kationer såsom K+, Rb+, Cs+ og NH4+

hæmmere:

• Kanchanomycin, mitomycin, bleomycin, phleomycin, ananthramycin, plurmycin A (Tanaka et al. 1965), and neomycin (Lazarus and Kitron 1973)
• Actinomycin inhibits only when guanosine and cytosine nucleotides are present (Cohen and Yielding 1965)
• Dideoxynucleoside
• Arabinosyl nucleotide triphosphate
• Deoxyuridine-5’-triphosphate and analogues of uridine and deoxyuridine with 5’-hydroxy or amino substituents (Kornberg 1974)
• Chloroquine and some of its analogs (Cohen and Yilding 1965)

Applications:

• høj procentdel inkorporering af radioaktivitet til nick translation assays
• Standard referencemateriale til undersøgelse af DNA-polymeraser
• fremstilling af alternerende copolymerer såsom poly D(A-T) og homopolymerer såsom poly dG-poly dC
• klenufragment: DNA-sekventering (Sanger et al. 1977), udfyldning af 5 ‘overhæng og fjernelse af 3’ overhæng for at danne stumpe ender (Sambrook 1989) og anden strengsyntese i mutagenese (Gubler 1987)