Testbeskrivelse

MLH1 kodende eksoner 1-19, msh2 kodende eksoner 1-16, MSH6 kodende eksoner 1-10 og PMS2 kodende eksoner 1-15 og langt ind i 5′ og 3′ enderne af alle introner og uoversatte regioner analyseres ved sekventering. Brutto sletning / duplikationsanalyse bestemmer genkopienummer for alle kodende eksoner af MLH1, MSH2, MSH6 og PMS2 og kodende ekson 9 af EPCAM. Inversionen af kodende eksoner 1-7 af msh2-genet detekteres af NGS og bekræftes ved PCR-og agarosegelelektroforese. Klinisk signifikante introniske fund ud over 5 basepar rapporteres altid. Introniske varianter af ukendt eller usandsynlig klinisk signifikans er ikke rapporteret ud over 5 basepar fra splejsekrydset. Genomisk deoksyribonukleinsyre (gDNA) isoleres fra patientens prøve ved hjælp af standardiseret metode og kvantificeres. Sekvensberigelse af de målrettede kodende eksoner og tilstødende introniske nukleotider udføres ved hjælp af en agnfangningsmetode ved anvendelse af lange biotinylerede oligonukleotidprober efterfulgt af polymerasekædereaktion (PCR) og næste generations sekventering (NGS). Sanger-sekventering udføres for alle regioner, der mangler eller med utilstrækkelig læsedybdedækning til pålidelig detektering af heterosygøs variant. Potentielt homosygøse varianter, varianter i regioner kompliceret af pseudogeninterferens og variantopkald, der ikke opfylder dækningsdybden og variantallelfrekvenskvalitetstærskler, verificeres ved Sanger-sekventering. Brutto sletning / duplikationsanalyse af MLH1, MSH2, MSH6 og PMS2 ved hjælp af læsedybde fra NGS-data og EPCAM ved hjælp af multipleks ligeringsafhængig probe amplifikation (MLPA) udføres også. Eventuelle ændringer i kopiantal, der opdages af NGS, bekræftes af målrettet kromosomal mikroarray og/eller mlpa. Hvis der opdages en sletning i eksoner 13, 14 eller 15 af PMS2, dobbeltstrenget sekventering af den eller de relevante eksoner af pseudogenet, PMS2CL, udføres for at bestemme, om sletningen er placeret i PMS2-genet eller pseudogenet. Hvis der registreres en sletning i ekson 9 i EPCAM, udføres sletning / duplikationsanalyse af kodende eksoner 3 og 8 i EPCAM. For EPCAM rapporteres kun grove sletninger, der omfatter 3 ‘ – enden af genet.