Disc degeneration er en almindelig tilstand med en kompleks multifaktoriel ætiologi. 1 lavgradig infektion er blevet foreslået som en årsag til disc degeneration med Propionibacterium acne identificeret hos 84% af patienterne med disc herniation og ischias ved hjælp af serologi og kulturer. 2 molekylære ændringer er også blevet observeret, såsom den øgede produktion af kataboliske stoffer (cathepsin, lysosym og flere matricer metalloproteinaser) og inflammatoriske cytokiner. 3 unge patienter med lumbal disc herniation viste dårligere bedring efter operationen, da de havde vist forhøjede serumkoncentrationer af højfølsomt C-reaktivt protein (hs-CRP) præoperativt. Det er imidlertid ikke klart, om høje niveauer af CRP og inflammatoriske cytokiner indikerer en lokal infektion eller en inflammatorisk reaktion på skiveudbrud. 4

patogener som Parvo virus B19 eller Epstein Barr Virus (EBV) spiller en vigtig rolle i patogenesen af forskellige former for arthritis. 5,6 herpesvirus er en forskelligartet familie af store DNA-vira, som alle kan etablere livslange latente infektioner. Primær infektion med mange af disse vira er almindelig i barndommen. 7,8

denne undersøgelse havde til formål at undersøge den potentielle rolle af herpesvirus, herpesvirus type-1(HSV-1), herpesvirus type-2 (HSV-2) og Cytomegalovirus (CMV) i patogenesen af degeneration af intervertebral disk. En molekylær analyse af intervertebrale skiveprøver opnået under discektomi viste en betydelig frekvens af CMV og HSV-1 DNA i degenererede diske, hvilket antyder, at virusinfektioner kan være en vigtig faktor i ætiologien af denne sygdom.

patienter og metoder

i alt 16 på hinanden følgende patienter, der gennemgik discektomi inden for seks måneder efter lumbal disc herniation blev undersøgt. Der var otte mænd og otte kvinder med en gennemsnitlig alder på 40,38 år (17 til 65). Undersøgelsen havde etisk godkendelse. Diagnosen af lumbal disc herniation blev etableret ved fysisk undersøgelse og Mr. For at tilvejebringe en kontrolgruppe blev diskprøver opnået perkutant fra to patienter med thoracolumbar burstfrakturer, der var under operation. Disse patienter gennemgik også MR-undersøgelse præoperativt for at udelukke samtidig degeneration. Arten af de prøver, der blev testet i denne undersøgelse, tillod ikke inkludering af flere intervertebrale diske fra raske individer af etiske grunde, mens alternativet til kadaveriske prøver som kontroller blev opgivet, da størstedelen af den voksne befolkning har en historie med lændesmerter og diskdegeneration.

ud over materialet fra den hernierede disk opnået under discektomi blev der taget en perifer blodprøve fra hver patient. Vævsprøver blev anbragt i steriliseret polypropylen 1.5 ml rør og opbevaret ved -80 liter C, indtil DNA / RNA-ekstraktion og polymerasekædereaktion/ kvantitativ polymerasekædereaktion (PCR/krt-PCR) blev udført. Påvisningen af HSV-1 og CMV, IgM+ og IgG+ antistoffer fra plasmaet blev udført under anvendelse af et standard immunoassay.

DNA / RNA-ekstraktion.

genomisk DNA og total RNA blev ekstraheret fra vævsprøverne ved hjælp af NucleoSpin-vævs-kittet og NUCLEOSPIN-RNA-kittet (Macherey-Nagel GmbH og Co., D kurrren, Tyskland) i henhold til producentens anvisninger. Det oprensede RNA blev yderligere behandlet med DNaseI for at undgå enhver DNA-kontaminering. DNA-og RNA-prøvekoncentrationer blev bestemt ved hjælp af et spektrofotometer (260 nm) før PCR-amplifikation eller krt-PCR.

påvisning af herpesvirus DNA.

Vi testede otte forskellige herpesvirus (HSV-1/-2, Varicella-virus (VVV), EBV, CMV, humane herpesvirus 6, 7 og 8 (HHV6, HHV7 og HHV8)) ved hjælp af RhyMA Test-Herpes Screening i henhold til producentens anvisninger (Euroclone, Pavia, Italien). RhyMA-testen var baseret på den omvendte Hybridiseringsteknologi, der involverede multipleks-DNA-amplifikation ved PCR med specifikke biotinylerede primere, efterfulgt af hybridisering af de amplificerede og biotinylerede DNA-fragmenter med strimler på prober, der er specifikke for hver enkelt herpesvirus. En endelig udviklingsreaktion ved anvendelse af et biotin-streptavidinsystem var påkrævet til evaluering af resultaterne. Positive og forstærkningskontroller blev også inkluderet i hver strimmel. Til fortolkningen af resultaterne blev den udviklede strimmel af hver prøve justeret med en standardtabel. RhyMA Test-Herpes Screening er licenseret til in vitro diagnostisk brug, der bekræfter assayets høje specificitet og følsomhed. For at verificere de opnåede resultater ved anvendelse af RhyMA Test-Herpes screening assay blev PCR-produkterne også kørt i en 3% lavsmeltende agarosegel, der producerede det forventede elektroforetiske mønster for hver virus. Endelig blev de PCR-positive prøver underkastet direkte sekventeringsanalyse, hvilket bekræftede de opnåede resultater ved anvendelse af RhyMA Test-Herpes screening assay.

HSV-1 og CMV-PCR.

Total RNA blev omvendt transkripteret ved hjælp af RETRO-script kit (Ambion Inc., Austin, USA) med tilfældige sekskamerprimere. cDNA ‘er blev testet for skabelonkvalitet ved at konstruere standardkurver ved hjælp af serielle fortyndinger af hver cDNA som skabeloner i PCR’ er. CDNA-skabelonerne gav en analyseeffektivitet på 90% til 105%, og R2 for alle standardkurver var > 0,98. Efter omvendt transkription blev cDNA ‘er amplificeret ved anvendelse af ICP0 – og IE1-specifikke primere til kvantificering af HSV-1 og HCMV mRNA’ er, henholdsvis, som tidligere beskrevet. 9,10

alle PCR ‘ er blev udført i tre eksemplarer ved hjælp af Maksima SYBR grøn Masterblanding (Fermentas Inc., Glen Burnie, Maryland) i en Abi PRISM 7500 Sekvensdetektor (PE Biosystems, Foster City, Canada), inklusive de ekstraherede RNA-prøver samt positive og negative kontroller. SYBR grøn fluorescens blev målt i løbet af 40 amplifikationscyklusser. For hver kvantificeret skabelon blev det gennemsnitlige cyklusnummer, hvor produktakkumulering kom ind i det lineære interval (CT), beregnet. Replikere CT-værdier var inden for 0,4 cyklusser af hinanden. 18SRRNA CT-værdien for en given skabelon blev trukket fra den CT, der blev opnået for hvert mRNA af interesse (ICP0 og IE1) fra den samme skabelon for at opnå den normaliserede CT-værdi (KARRCT) for hver skabelon.

tumornekrosefaktor-Kurt og Interleukin-6-genekspression.

til kvantificering af TNF-Purpur eller IL-6 mRNA blev 1 Purpur af cDNA anvendt sammen med de ovenfor viste primere i en 20-purpurreaktion ved anvendelse af SYBR green som markør for DNA-indhold. De anvendte primere var: beta actin: fremad: 5 ‘- TCAGAAGAACTC CTA TGT GG-3’, omvendt: 5 ‘- TCT CTT TGA TGT CAC GCA CG-3′; TNF-a fremad: 5′-CAC GCT CTT CTG TCT ACT GAA CTT CG-3′, omvendt: 5′-GGC TGG GTA GAG AAT GGA TGA ACA CC-3′, 11 IL-6: fremad: 5′-ACA GCC ACT CAC CTC TTC AG -3′, omvendt: 5′ – GTG CCT CTT TGC TGC TTT CAC -3’. 12 der var ingen biprodukter til stede i reaktionen som angivet ved dissociationsmønsteret tilvejebragt ved reaktionens afslutning og ved agarosegelelektroforese (data ikke vist). Forstærkningseffektiviteten af TNF-kurr og IL-6-produkterne var de samme som for beta actin som angivet ved standardkurverne for amplifikation, hvilket gjorde det muligt for os at bruge formlen: fold stigning = 2 – (krt A-krtb). Reaktionerne blev udført i tre eksemplarer for at muliggøre statistisk evaluering.

resultater

en PCR–revers hybridiseringsassay blev anvendt til at screene for DNA fra otte forskellige herpesvirus i de intervertebrale skiveprøver hos patienter med skiveudbrud (Fig. 1). Herpesvirus DNA blev påvist i 13 ud af 16 prøver (81,25%). HSV – 1 viste den højeste prævalens hos ni patienter (56,25%), mens CMV blev påvist hos seks patienter (37,5%) (tabel i). To patienter blev co-inficeret med både HSV-1 og CMV. DNA fra HSV-2, EBV, HHV6, HHV7 og HHV8 blev ikke påvist i diskprøverne hos nogen af patienterne. Ingen af kontrolpatienterne (C1 og C2) testede positive for tilstedeværelsen af herpesvirus-DNA (Fig. 1).

status for HSV-1 og CMV-infektion i de intervertebrale skiveprøver blev undersøgt ved at undersøge den potentielle ekspression af virale transkripter ved hjælp af realtids-PCR. Herpesvirusgenekspression blev ikke påvist i nogen af de testede prøver, hvilket demonstrerede fraværet af en aktiv virusinfektion, hvilket antyder etablering af latent herpesvirusinfektion i disse prøver.

patientens seropositivitet blev også undersøgt. Alle HSV-1 eller CMV PCR-positive patienter præsenterede henholdsvis IgG+ antistoffer for den samme virus (tabel i). I tre tilfælde for HSV-1 og i seks tilfælde for CMV blev IgG+ antistoffer påvist uden samtidig forekomst af viralt DNA. Desuden var HSV-1-og CMV IgM+ – antistofferne fra det perifere blod negative hos alle patienter, hvilket indikerer, at ingen af patienterne havde oplevet en akut herpesvirusinfektion på tidspunktet for kirurgisk udskæring.

bortset fra den makroskopiske indikation af betændelse omkring herniated disc, opnåede vi også eksperimentelle tegn på betændelse i de intervertebrale skiveprøver ved at undersøge mRNA-niveauerne af TNF-larr og IL-6 i alle prøver ved hjælp af krt-PCR. Analysen viste ca. to til tredobbelt forøgelse af begge inflammatoriske markører i prøverne sammenlignet med kontrollerne (Fig. 2). Interessant nok viste de patienter, der var co-inficeret af både HSV-1 og CMV, de højeste niveauer af TNF-kurr og IL-6. Desuden udviste to ud af tre patienter (patienter 2 og 8) uden tegn på virusinfektion lavere niveauer af TNF-kurr. Denne negative korrelation blev ikke fundet for IL-6 niveauer hos disse patienter.

Diskussion

den nuværende undersøgelse antyder konceptet om, at herpesvirusinfektion kan fremme diskdegeneration. Vi var i stand til at detektere HSV-1 og CMV DNA i et stort antal humane intervertebrale skiveprøver høstet under discektomi.

tidligere lavgradig infektion er blevet foreslået som en mulig årsag til diskdegeneration. 2,4 flere forfattere har understreget forholdet mellem Modiske type 1-signaler (øget marvsignalintensitet i T2-vægtede MR-billeder og nedsat signalintensitet i T1-vægtede MR-billeder og fibrovaskulært væv i endepladerne) og infektion. 13,14 hvis patienterne ikke har alvorlige rygsmerter, temperatur eller en unormal blodprofil, er det vanskeligt at skelne mellem Modic 1-ændringer og lavgradig infektion. 13,14

forholdet mellem viral infektion og apoptose er blevet undersøgt bredt, hvilket præciserer mekanismerne for apoptoseinduktion af vira. 15,16 det er nu kendt, at Parvovirus B19 og især dets NS-1-protein har en potent cytotoksisk virkning på værtscellerne og forårsager apoptose i de inficerede celler. 17 vira spiller en rolle i patogenesen af forskellige former for arthritis. 5 detekterede viralt DNA fra flere vira i synovialt væv taget fra patienter med tidlig arthritis. En nylig undersøgelse antydede, at de avancerede stadier af slidgigt kan være relateret til øget betændelse og skade på ledbrusk på grund af Parvovirus B19. 18 i en anden undersøgelse blev det foreslået, at humant Parvovirus B19 er involveret i initiering og opretholdelse af synovitis ved reumatoid arthritis, hvilket fører til ledlæsioner i løbet af overdreven syntese af inflammatoriske cytokiner og proteolytiske stoffer. 19

HSV-1 infektioner er endemiske over hele verden. Over 90% af voksne har antistoffer mod HSV-1 i det femte årti. Herpesvirus er allestedsnærværende patogener hos børn, der forbliver latente efter en aktiv infektion. 20,21 I den indledende fase af infektionen forekommer viral replikation i ganglier med overlevelse af nogle celler, der opretholder viralt genom kompatibelt med normal cellulær funktion. Denne fine balance mellem værtsceller og virussen kan forstyrres af forskellige stimuli, hvilket fører til reaktivering. 22

i vores undersøgelse havde ingen af patienterne oplevet akut herpesinfektion. Dette var tydeligt både på det serologiske niveau på grund af fravær af IgM+ antistoffer fra det perifere blod såvel som på molekylært niveau på grund af manglen på virale mRNA-transkripter fra diskprøverne. Således kan den høje forekomst af HSV-1-infektion i barndommen såvel som dens tilbageholdelse i nervesystemet give en tilfredsstillende forklaring på tilstedeværelsen af både HSV-1 og CMV i den intervertebrale skive.

spørgsmålet opstår, hvordan vira kommer ind i det intervertebrale diskrum. Det er velkendt, at store vaskulære kanaler krydser endepladerne i det tidlige fosterliv, som efterfølgende falder med fødslen og helt forsvinder i alderen fire til seks år, hvilket gør disken til en af de største avaskulære vævstyper i kroppen. 23 man kan spekulere i, at tilstedeværelsen af viralt DNA i den intervertebrale skive er sekundær til migrationen af makrofager eller andre celler, der indeholder viralt DNA i disken i barndommen, mens diskmiljøet stadig er rig på blodkar. Andre mekanismer kan også spille en rolle, da det er velkendt, at herpesvirus kan aktiveres i neuronale aksoner af inflammatoriske cytokiner, såsom IL-1 og TNF-Kurt 24,25 og gennem antidromal migration kan involvere diskrummet.

således aktiverer den betændte eller skadede disk, der producerer en række proinflammatoriske cytokiner, latente vira. Disse mekanismer kunne også forklare tilstedeværelsen af DNA fra to eller flere vira i diskprøverne. Selv hvis tilstedeværelsen af vira er et sekundært fænomen, kan deres tilstedeværelse bidrage til patogenesen af degeneration af intervertebral skive, da virale antigener yderligere forbedrer skiveforringelse ved aktivering af det inflammatoriske miljø, hvilket letter aktiverede makrofager og andre celler til at forårsage vævsskade.

i vores undersøgelse afslørede intraoperativ vurdering af det kirurgiske felt makroskopiske tegn på betændelse omkring herniated disc. Beviset for betændelsen i skiveprøverne og bidraget fra virusinfektion til forbedringen af den inflammatoriske proces kom fra analysen af mRNA-niveauerne af velkendte gener, som er forbundet med inflammation, såsom TNF-larr og IL-6. Begge inflammatoriske markører viste ca.to til tre gange højere niveauer i patienternes prøver sammenlignet med kontrollerne. Interessant nok udviste de prøver, der blev co-inficeret af både HSV-1 og CMV, de højeste niveauer af TNF-kurr og IL-6, hvilket antyder en synergistisk virkning af viraerne. Derudover var niveauerne af TNF-karrus så lave som kontroltilfældene blandt patienterne, hvor vi ikke kunne påvise viralt DNA.

en nylig gennemgangsartikel siger, at diskdegeneration ikke er en diagnose, men et udtryk for diskens tilstand, hvilket er resultatet af flere faktorer, der handler, individuelt eller kollektivt. 1 i stedet for at være resultatet af en enkelt proces kan disc degeneration have en række mulige årsager, herunder mekanisk, aldring, genetisk, systemisk, toksisk og/eller infektion. Fraværet af viral detektion hos alle vores 16 patienter er i overensstemmelse med den multifaktorielle årsag til diskprolaps. Det er kendt, at genetiske faktorer producerer unormale komponenter i matricen 26-28, som kompromitterer diskens struktur og funktion og øger skivevævets modtagelighed for mekanisk belastning. 29 epidemiologiske undersøgelser har vist, at genetiske faktorer øger risikoen for degeneration, 30-35, men de tager ikke højde for alle tilfælde, 28,36 med variationer på tværs af forskellige etniske populationer 37 således at store multietniske befolkningsundersøgelser er påkrævet. 38

tilstedeværelsen af vira i disken kan skabe en indstilling, hvor disken er sårbar over for skader som følge af mekanisk belastning og traume. Det er sandsynligt, at viralt DNA ville være til stede på intervertebrale skiver niveauer, men de mekaniske belastninger, der postuleres for at bidrage til degenerationen, finder sted på lumbosakral niveau, hvor problemer er langt mere almindelige. 1 lavgradig infektion, med eller uden genetisk indflydelse, kan øge følsomheden af den intervertebrale skive over for miljøfaktorer, som sekundært driver de biologiske begivenheder, der resulterer i diskdegeneration. Herpes-DNA fungerer muligvis som en faktor, der ændrer de strukturelle egenskaber ved matricen i disken ved at modulere apoptose og lokal inflammatorisk respons, hvilket antyder, at virusinfektion eller reaktivering er forbundet med sygdommen.opdagelsen af Marshall og Varren 39 at infektion med Helicobacter pylori var ansvarlig for udviklingen af mavesår fører til et stort skift i medicinsk forståelse. Muligheden for, at en infektiøs proces kan bidrage til diskdegeneration, bør overvejes alvorligt.

Vi mener, at dette er den første undersøgelse, der dokumenterer tilstedeværelsen af herpesvirus i intervertebral disc hos patienter med disc herniation. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at bestemme de underliggende mekanismer og understøtte herpesviraens potentielle rolle i patogenesen af degenerativ skivesygdom.

ingen fordele i nogen form er modtaget eller vil blive modtaget fra en kommerciel part, der direkte eller indirekte er relateret til emnet i denne artikel.