PMC
tekst
vira oplever helt forskellige miljøer afhængigt af om de replikerer inde i en værtscelle eller i transit fra en vært til en anden. I en celle udsættes virus-og viruskomponenterne for et reducerende miljø, hvor redokspotentialet primært bestemmes af glutathion (18). I modsætning hertil udsættes virussen uden for en celle for ilt og giftige produkter afledt af ilt, såsom brintoverilte, superilte og reaktive arter, der har potentialet til at inaktivere virussen. For at klare sådanne stærkt reaktive forbindelser er planter og dyr i stand til at omdanne dem til ikke-toksiske produkter. Eksempler herpå er katalase, peroksidase og superkildesimutase (28). Her beskriver vi resultaterne af undersøgelser, der viser tilstedeværelsen af katalase inde i den rensede herpes simpleks virion. Test blev derefter Udført for at bestemme, om intern katalase kunne beskytte virussen mod inaktivering af H2O2.
undersøgelser af katalase blev udført med herpes virus 1 (HSV-1), der blev dyrket på Vero-celler i kultur og oprenset ved centrifugering af saccharosetæthedsgradient. Når virussuspensioner blev justeret til 1% H2O2, begyndte der straks at dannes bobler af ilt, hvilket indikerer tilstedeværelsen af katalase (Fig. 1A, venstre rør). Bobler blev synlige visuelt efter nogle få sekunders inkubation ved stuetemperatur og fortsatte med at danne og forstørre i mindst 20 minutter. Der blev imidlertid ikke dannet bobler, hvis katalaseinhibitoren natriumatsid blev tilsat til virussuspensionen før H2O2-behandling (Fig. 1A, højre). Assays var også negative, når (i) virussen blev fjernet fra opløsningen ved centrifugering før tilsætning af H2O2 eller (ii) HSV-1 capsider (B capsider) blev erstattet af intakt virus. I lignende analyser blev bobler, der indikerer tilstedeværelsen af katalase, ikke observeret med oprenset vesikulær stomatitisvirus eller humant adenovirus 2 (data ikke vist). Vestlig blot-analyse bekræftede tilstedeværelsen af katalase forbundet med HSV-1-virus, men ikke med adenovirus, vesikulær stomatitis-virus (VSV) eller HSV-1 A-capsider (Fig. 1b).
identifikation af HSV-1-associeret katalase ved analyse (a), vestlig blot-analyse (b) og centrifugering af saccharosetæthedsgradient (c). Panel A viser et rør indeholdende oprenset HSV – 1 20 min efter opløsningen blev justeret til 1% H2O2 (venstre rør) og en lignende inkubation, hvortil en katalasehæmmer (2 mM natriumatsid) blev tilsat før H2O2 (højre). Bemærk dannelsen af bobler i venstre rør, hvilket indikerer tilstedeværelsen af katalase i virussen. Viruskoncentrationen var 0,25 mg / ml i TNE (0,01 m Tris-HCl, 0,5 M NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,5), og inkubationen var ved stuetemperatur. Virussen var KOS-stammen af HSV-1, som blev dyrket på monolagskulturer af Vero-celler og oprenset ved saccharose densitetsgradientcentrifugering, og titeren blev bestemt ved endepunktfortynding som tidligere beskrevet (14). Panel b viser resultaterne af en vestlig blot test for tilstedeværelsen af katalase i HSV-1, humant adenovirus 2 (HAd2), vesikulær stomatitis virus (VSV) og HSV-1 A capsider. Humant adenovirus 2 og vesikulær stomatitis virus (Indiana; San Juan stamme) blev dyrket på monolagskulturer af henholdsvis HeLa-og Vero-celler og oprenset ved tidligere beskrevne procedurer (12, 17). Offentliggjorte metoder blev også anvendt til oprensning af HSV-1 A og B capsider (23). Større kapsidproteiner blev påvist ved farvning af pletten med 1% Ponceau s (øverste række), mens katalase blev påvist ved immunfarvning med antistof specifikt for katalase (Calbiochem; kanin polyklonal 219010; 1:5.000 fortynding) (15). Bemærk, at katalase blev påvist i HSV-1-virus, men ikke HAd2, VSV eller HSV-1 A capsider. Panel c viser resultaterne af saccharose densitetsgradientanalyse. I alt 50 liter renset HSV-1 i 50 liter tne blev centrifugeret på en 600-liter gradient på 20% til 50% saccharose i tne. Centrifugering var i 45 minutter ved 22.000 omdr. / min. i en Beckman S55-rotor ved 4 liter C. gradienten blev fraktioneret, og individuelle fraktioner blev analyseret ved SDS-side efterfulgt af blotting på polyvinylidendifluorid (PVDF) og farvning med 1% Ponceau S. pletten blev derefter destineret og farvet med antistof specifikt for katalase (som vandrede tilfældigt med standardkatalase; Værdington LS001872). Bemærk, at virussens position i gradienten (øverste række) falder sammen med katalase (nederste række), hvilket antyder, at de to er forbundet.
kontrolforsøg blev udført for at bekræfte, at catalase var forbundet med HSV-1 og ikke med urenheder til stede i viruspræparatet. Oprenset HSV-1 blev centrifugeret i et bånd på en saccharosetæthedsgradient, gradienten blev fraktioneret, og vestlig blot-analyse blev anvendt til at teste individuelle gradientfraktioner for tilstedeværelsen af katalase. Resultaterne viste, at katalase var til stede i virusholdige fraktioner, men ikke i flankerende fraktioner (Fig. 1c). Resultaterne fortolkes for at indikere, at katalase er forbundet med HSV-1 og ikke med forurenende stoffer, såsom katalaseholdige bakterier eller værtscellematerialer i viruspræparatet. Da HSV-1-genomet ikke koder for katalase (22), skal det virusassocierede f.eks. Tidlige studier af vaccinia-virus viste tilstedeværelsen af catalase inde i den modne virion (8). Bortset fra denne observation kender vi ingen anden rapport om katalase som en komponent i en virusstruktur.
yderligere analyse af HSV-1-associeret katalase var rettet mod at bestemme placeringen af fsymet i virionen. To typer eksperimenter blev udført. For det første blev oprenset virus behandlet med den proteolytiske pronase for at nedbryde virusglycoproteinerne og eventuelle proteiner, der ikke er indeholdt i virionmembranen. Interne virale proteiner forventedes at være upåvirket, da pronase ikke krydser viruslipid-dobbeltlaget (16). Efter pronasebehandling blev virussen høstet ved centrifugering, og omfanget af katalasetab blev bestemt ved vestlig blot-analyse. Resultaterne viste ingen tegn på katalasetab i to testede viruskoncentrationer (se katalasebåndet i Fig. 2A, spor 1 og 2). Interne kontroller viste, at virusoverfladen glycoproteiner gB og gH blev spaltet som forventet (Fig. 2A; sammenlign spor 2 og 3). Tilsvarende viste vestlig blot-analyse, at HSV-1 glycoprotein d blev fordøjet af pronase eller trypsin under betingelser, hvor katalase ikke blev påvirket (Fig. 2b). Oprenset katalase i opløsning blev også fordøjet under de samme betingelser. I modsætning hertil er der ingen nedbrydning af indre tegument (UL47, UL48 og UL49) eller kapsidproteiner (UL19, UL38, UL18; Fig. 2A, Bane 1 og 2) blev observeret. Resultaterne fortolkes for at indikere, at katalase er placeret inde i HSV-1-konvolutten.
lokalisering af katalase i HSV-1 ved behandling af oprensede virioner med pronase (Bane 1 til 3) og Triton H-100 (a, bane 4 og 5) og ved behandling med pronase og trypsin (B, Bane 1 til 3). Panel A viser SDS-PAGE og vestlige blot analyse af proteiner til stede i intakt HSV-1 (bane 3 og 4) og i virioner efter behandling med pronase (Bane 1 og 2) og Triton HS-100 (bane 5). Bemærk, at catalase viste sig at være til stede i intakte virioner (Bane 3 og 4) og i pronasebehandlede virioner (Bane 1 og 2), men ikke i virioner efter behandling med 1% Triton H-100 (bane 5). Pronase-behandling blev udført ved fordøjelse af oprenset HSV-1 (0,25 mg/ml) med 1 mg/ml pronase (Streptomyces griseus; Calbiochem 537088) i 4 timer ved 37 liter C. Efter pronase-behandling blev virussen reisoleret ved saccharosetæthedsgradientcentrifugering før SDS-PAGE og vestlig blot-analyse. Triton H-100-behandlingen blev udført ved at justere oprenset virus til 1% Triton H-100 i tne-buffer indeholdende 10 mM dithiothreitol (DTT) og inkuberes i 15 minutter på is (4 liter C). De resulterende kapsider blev derefter oprenset ved saccharosegradientcentrifugering før SDS-side og vestlig blot-analyse. (B) vestlig blot-analyse af oprenset HSV-1 efter behandling in vitro med pronase eller trypsin. I alt 100 liter renset HSV-1 (1 mg/ml) blev justeret til 2 mg/ml pronase eller 2 mg/ml trypsin. En kontrolinkubation havde ikke noget. Blandinger blev inkuberet i 2 timer ved 37 liter C, og virioner blev oprenset ved centrifugering på en 20% til 50% saccharosegradient som beskrevet i legenden til Fig. 1. Virusprøver blev pelleteret ved centrifugering og undersøgt ved SDS-PAGE og vestlig blot-analyse. Blots blev farvet for katalase (kanin polyklonal; se ovenfor) og glycoprotein D (mus monoklonalt antistof DL11; en gave fra Gary Cohen og Roselyn Eisenberg; 1:5.000). Bemærk, at proteasebehandling forårsagede fordøjelse af glycoprotein D, men ikke katalase, hvilket indikerer, at katalase er placeret inde i HSV-1-membranen.
en mere præcis definition af placeringen af katalase blev opnået ved behandling af oprenset virus med det nonioniske vaskemiddel Triton H-100 (TH-100). Når den udføres med frisk virus, forårsager denne behandling tab af virusmembranen, membranglycoproteinerne og næsten alle de 20 eller flere tegumentproteiner (alle undtagen UL36, UL37 og US3) (13, 21, 27). Capsid bevarer imidlertid sin integritet, og ingen af de største capsid-proteiner går tabt. Virus-DNA ‘ et bevares inde i kapsidet. Eksperimenter involverede behandling af HSV-1 med 1% th-100 og isolering af de resulterende kapsider ved centrifugering af saccharosetæthedsgradient. Vestlig blot-analyse blev derefter brugt til at teste kapsiderne for tilstedeværelsen af katalase. Resultaterne viste, at virusglycoproteinerne og tegumentproteinerne blev fjernet som forventet, og at katalase også blev fjernet (se Fig. 2A, spor 4 og 5). Dette eksperiment fortolkes for at indikere, at katalase er til stede i HSV-1 tegument.
oplysninger som den, der er vist i Fig. 2 kan bruges til at bestemme antallet af katalasemolekyler pr HSV-1 virion (15). Denne måling blev udført begyndende med to identiske alikvoter af oprenset virus. De to blev anvendt til bestemmelse af (i) antallet af store kapsidproteinmolekyler (UL19) fra en Coomassie-blåfarvet gel og (ii) antallet af 60-kDa-katalasemolekyler fra en kalibreret vestlig blot. I en repræsentativ bestemmelse gav denne analyse en værdi på 1: 207,5 for molforholdet mellem katalase og UL19. Da der er 955 UL19 molekyler pr. HSV-1 kapsid, blev antallet af katalasemolekyler pr.kapsid bestemt til at være 955/207, 5 eller 4, 6. En anden lignende bestemmelse gav en værdi på 7,1 katalasemolekyler. Da der er fire 60-kDa-underenheder i et aktivt katalasemolekyle (11, 20), indikerer resultaterne tilstedeværelsen af 1 til 2 katalasetramere pr.
tilstedeværelsen af katalase inde i HSV-1-virionen antyder muligheden for, at det kan være involveret i beskyttelse af virussen mod oksidativ skade ved H2O2. Alternativt kan katalase inkorporeres passivt i HSV-1, da tegumentet tilsættes i værtscellecytoplasmaet og ikke har nogen beskyttende funktion. For at skelne mellem de to muligheder undersøgte vi følsomheden af oprenset HSV-1 til inaktivering ved H2O2in vitro. HSV-1 blev behandlet med H2O2 i nærvær eller fravær af katalaseinhibitoren natriumatsid (NaN3), og virustiteren blev derefter bestemt (i fravær af katalaseinhibitor). Resultaterne viste, at mens 50 mM H2O2 producerede et beskedent fald i titer (3 – til 4 gange), blev der observeret en dødelig virkning på 106 gange eller derover, hvis NaN3 var til stede (tabel 1). Kontroleksperimenter viste lidt drab på HSV-1 af NaN3 alene (tabel 1). Resultaterne fortolkes for at indikere, at katalase giver et signifikant beskyttelsesniveau mod inaktivering af HSV-1 ved H2O2.
tabel 1
Virustiter efter behandling med H2O2 med eller uden en katalasehæmmer (NaN3)a
| behandling | titer | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| tid i 10 mm H2O2 | tid i 50 mm H2O2 | ||||||
| ingen | 2 h | 20 h | ingen | 2 h | 20 h | ||
| ingen NaN3 | ingen NaN3 | 28 × 1010 | 60 × 1010 | 8 × 1010 | 28 × 1010 | 10 × 1010 | 8 × 1010 |
| 2 mM NaN3 | 30 × 1010 | 6 × 1010 | < 104 | 30 × 1010 | 1 × 1010 | <104 | |
det forventes ikke, at HSV-1 skal beskyttes mod oksidativ skade af H2O2, mens det er forbundet med en værtscelle. Som beskrevet ovenfor findes et reducerende miljø i cellen, og det ville forhindre dannelse af H2O2. Uden for værtscellen er miljøet imidlertid en iltning, der er i stand til at producere H2O2 både inde i virussen og i det omgivende medium. HSV-1 ville støde på dette miljø, da det overføres fra en vært til en anden, og katalase kan være involveret i beskyttelse af HSV-1-infektivitet under transit. HSV-1-associeret katalase kan også yde beskyttelse mod H2O2 produceret af kommensale bakterier eller andre kilder. H2O2 produceret af lactobaciller har for eksempel vist sig at beskytte den kvindelige kønsorgan mod sygdom på grund af mikrobiel infektion (4). På grund af dets høje katalytiske hastighed kunne virusassocieret katalase have en rolle i beskyttelsen af HSV-1 på trods af dets lave kopiantal (1 til 2 kopier pr. Leverkatalase er for eksempel i stand til at afgifte titusindvis af H2O2-molekyler pr.sekund, blandt de højeste katalytiske hastigheder, der er rapporteret for et hvilket som helst f. eks. (2).
alle vira i herpesfamilien har et tegument, et lag af protein, der ligger mellem viruskapslen og membranen (5, 6, 9, 13). HSV-1 tegument er 40 til 50 nm i tykkelse og består af cirka 20 forskellige proteinarter, hvoraf næsten alle er kodet i virusgenomet. Tegumentproteiner adskiller sig væsentligt i deres overflod i virionen med 800 kopier eller mere af de største arter, såsom UL47, UL48 og UL49 (se Fig. 2A, Bane 3) (5, 16). Mange tegumentproteiner er involveret i tidlige trin af HSV-1-replikation, såsom aktivering af tidlig gentranskription og dæmpning af værtscelleproteinsyntese (13, 24, 25). Tegumentet samles i den spirende HSV-1-virion som en DNA-indeholdende kapsidknopper i en vesikel af trans-Golgi-netværket (10). Det foreslås, at katalase inkorporeres sammen med andre tegumentproteiner under den spirende proces.
i uinficerede celler findes mest katalase sekvestreret i peroksisomer (26). For at det kan inkorporeres i afkom HSV-1 under tegumentation som beskrevet ovenfor, katalase skulle frigives fra peroksisomer. Vi foreslår, at dette kan finde sted som en konsekvens af den store omlægning af cytoplasmatiske membraner, der ledsager HSV-1-replikation (1).
Palamara et al. (19) har vist, at et fald i den cytoplasmatiske glutathionkoncentration forekommer straks efter, at Vero-celler er inficeret med HSV-1. Et fald i glutathionkoncentration forventes at forårsage et fald i det cytosoliske reduktionspotentiale, og dette fald ser ud til at forstærke HSV-1-replikation. Ekstra glutathion tilvejebragt i vækstmediet viste sig at modvirke HSV-1-vækst (19). Ligesom eksternt tilsat glutathion kan cytosolisk katalase øge cytoplasmens reducerende potentiale ved at fjerne H2O2. Det foreslås derfor, at en konsekvens af inkorporering af katalase i afkom virioner kan være at forstærke virusvækst ved at fratage inficerede celler af katalase.
det lille antal katalasemolekyler pr.virion kan forklare, hvorfor det ikke blev påvist i en massespektrometrisk analyse af hele HSV-1-virioner (7). Der er flere HSV-1-virionproteiner med høj kopi, der kan skjule signal fra katalase (for eksempel er der tusinder af kopier af glycoproteinmolekyler og 955 kopier af det største kapsidprotein ). Overfladen af katalase opfylder ikke den uformelle standard til påvisning ved massespektrometri (synlighed på en Coomassie-farvet SDS-PAGE gel). I den massespektrometriske analyse af HSV-1 (7, 26) blev der påvist peroksisomalt protein med antioksidant aktivitet.
i fremtiden kan det være muligt at udnytte følsomheden af HSV-1 til de cytotoksiske virkninger af H2O2. Det forventes, at virussen vil være særligt sårbar, når den er i et iltningsmiljø uden for værtscellen, og når katalase hæmmes.
Leave a Reply